4-(1-メチルエテニル)フェノールのラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of 4-(1-Methylethenyl)phenol in Rats

要約

4-(1-メチルエテニル)フェノールの0，30，100，300および400 mg/kgを1群につき雌雄各5匹のCrj:CD(SD)IGSラットに28日間反復経口投与してその毒性を検討した．また，投与終了の翌日から0，300および400 mg/kg投与群の雌雄各5匹について休薬後14日間観察を継続し，投与期間中にみられた毒性の回復性についても検討し，以下の成績を得た．

一般状態では，300および400 mg/kg投与群の雌雄ともに外尿道口周囲被毛の汚れがみられ，雌で流涎も認められた．

体重および摂餌量では，300および400 mg/kg投与群の雌で投与7日以降に体重増加抑制がみられ，摂餌量の低値も認められた．

尿検査では，300 mg/kg投与群の雄および400 mg/kg投与群の雌雄で尿量の高値，400 mg/kg投与群の雌雄で尿pHの低下，雄で飲水量の高値，雌で尿比重の低値が認められた．

血液学検査では，400 mg/kg投与群の雌で平均赤血球ヘモグロビン濃度の低値および活性化部分トロンボプラスチン時間の延長が認められた．また，雄の300および400 mg/kg投与群で回復終了時に平均赤血球ヘモグロビン濃度の低値が認められた．

血液生化学検査では，300 mg/kgの投与群の雌および400 mg/kg投与群の雌雄でγ-GTPの高値が認められた．また，400 mg/kg投与群の雄でβ-グロブリン比の高値，雌でα1-グロブリン比の高値が認められた．

剖検所見では，400 mg/kg投与群の雌雄で前胃粘膜の肥厚，さらに雌1例で盲腸の拡張および水様内容物，脾臓および胸腺の萎縮が認められた．

器官重量では，100 mg/kg投与群の雌，300 mg/kg以上の投与群の雌雄ともに肝臓の絶対重量の高値または高値傾向，300 mg/kg投与群の雄および400 mg/kg投与群の雌雄ともに肝臓の相対重量の高値，400 mg/kg投与群の雄で腎臓の絶対および相対重量の高値または高値傾向，さらに400 mg/kg投与群の雌で胸腺の絶対および相対重量の低値も認められた．

病理組織学検査では，100 mg/kg以上の投与群の雌で前胃の扁平上皮過形成が，100 mg/kg以上の投与群の雌雄で胃の境界縁における扁平上皮過形成が認められた．一方，400 mg/kg投与群の雄にのみ腎臓の近位尿細管上皮に硝子滴および好酸性小体が認められ，400 mg/kg投与群の雌では胸腺の萎縮が認められた．

投与期間中にみられたいずれの変化も，14日間の休薬により軽減または回復が認められ，可逆的な変化と考えられた．

以上により，本試験条件下における4-(1-メチルエテニル)フェノールの無影響量(NOEL)は，雌雄ともに30 mg/kg/dayと考えられた．

方法

1.　被験物質および対照物質の調製

被験物質は，4-(1-メチルエテニル)フェノール[ロット番号:001109，純度:99 %以上，提供者:三井化学(株)(東京)]で，蒸気圧3333 Pa(142 ℃)，融点80〜83 ℃，比重0.35〜0.4，引火点120〜125 ℃(セタ密閉式)の水に難溶，メチルアルコールおよびアセトンに可溶の白〜淡黄色の粉体である．4-(1-メチルエテニル)フェノールは室温ではゆるやかに2量化することから，遮光気密容器に入れ，-10 ℃以下に設定された冷凍庫に保存した．試験期間中の被験物質の安定性を，残余被験物質を用いた純度の分析成績により確認した．

0.5 %カルメロースナトリウム水溶液を用いて被験物質を懸濁した．調製液は調製後速やかに遮光気密容器に入れ，冷暗所に保存し調製後1週間以内に投与に用いた．

投与に先立って1および120 mg/mL調製液中の4-(1-メチルエテニル)フェノールの均一性および安定性ならびに投与に用いる各濃度の調製液中の4-(1-メチルエテニル)フェノール濃度を分析して確認した．

2.　試験動物および飼育条件

日本チャールス・リバー(株)厚木飼育センター生産のSPF Crj:CD(SD)IGSラットを4週齢で購入し，6〜7日間馴化飼育を行い，雌雄各40匹を5週齢で試験に供した．投与前日の体重に基づいて層化無作為抽出法により群分けを行った．

動物は温度22〜23 ℃，湿度45〜59 %，換気回数10〜15回/時間，照明時間8〜20時でブラケット式金属製金網床ケージに，群分け前は2あるいは3匹，群分け後は1匹収容した．飼料はg線照射固型飼料CRF-1(オリエンタル酵母工業(株))を金属製給餌器により，飲料水は札幌市水道水を自動給水装置により，それぞれ自由摂取させた．

3.　投与量および投与方法

致死量の概要を検索するために，雌雄各1群3匹のCrj:CD(SD)IGSラットに4-(1-メチルエテニル)フェ ノールの0，30，100および300 mg/kg/dayを，14日間連続経口投与した予備試験の結果，100 mg/kg投与群の雌1例のみに極軽度な貧血傾向，GOT，GPT，トリグリセリド，尿素窒素の高値およびグルコースの低値，さらに肝臓の黄白色化，腎臓および心臓の褪色等が認められた．この変化と被験物質投与との関連性については明らかではなかったが，他例には被験物質投与に関連した変化は認められなかった．このことから，28日間反復経口投与毒性試験の本試験では，雌雄ともに予備試験と同様に30，100および300 mg/kg/dayを設定した．また，急性毒性試験では，600 mg/kgで呼吸緩徐，体温低下，死亡等の毒性徴候が発現し，300 mg/kgでは変化がなく，LD50値は雌雄とも585.8 mg/kgであったことから，300 mg/kg/dayの投与で毒性変化が発現しない可能性を考慮し，300と600の等比中項の近似値である400 mg/kg/dayも設定した．

1日1回，28日間，9:00から11:30の間に胃ゾンデを用いて強制的に胃内に10 mL/kgの投与容量で経口投与した．なお，投与は調製終了後1時間以内に行った．

4.　検査項目

1)　一般状態観察

投与開始日を投与1日，投与28日の翌日を回復1日としてそれぞれ起算し，投与終了時解剖例は投与28日の翌日の剖検日まで，回復終了時解剖例は回復14日の翌日の剖検日まで，個々の動物の生死，外観，行動等について，毎日の投与前および投与後に各1回観察した．回復期間中は毎日1回観察した．

2)　体重および摂餌量測定

個々の動物の体重および摂餌量を，投与1，2，7，14，21および28日の投与前，回復1，7および14日に，各期間終了の翌日の剖検日にも体重を電子式上皿天秤を用いて測定した．体重増加量および体重増加率を投与期間中は体重増加量=(投与28日体重)-(投与1日体重)，体重増加率=[(体重増加量)/(投与1日体重)]× 100，回復期間中は体重増加量=(回復14日体重)-(回復1日体重)，体重増加率=[(体重増加量)/(回復1日体重)]× 100により算出した．摂餌量は給与量から残量を減じた後，1日分の消費量を算出した．

3)　尿検査

投与4週および回復2週に，全例について非絶食下でラット用代謝ケージ((株)夏目製作所)を用いて採尿し，投与直後から3時間前後までに排泄した新鮮尿についてpH，蛋白，糖，ケトン体，ウロビリノーゲン，ビリルビン，潜血反応(以上，マルティスティックス，バイエルメディカル(株))，色調(肉眼観察)，沈渣(鏡検)を，また約21時間の蓄尿で尿量(容量測定)および比重(屈折計法，アタゴ(株))を測定し，同時に採尿中の飲水量(重量測定)を測定した．

4)　血液学検査

全例について，約16〜22時間絶食させたラットをエーテル麻酔し，腹部大動脈より採血した．EDTA・2Kで処理した血液約1 mLを用い，赤血球数，ヘマトクリット値，血小板数，白血球数(以上，電気抵抗法)，ヘモグロビン量(シアンメトヘモグロビン法)，平均赤血球容積(赤血球数，ヘマトクリット値より算出)，平均赤血球ヘモグロビン量(赤血球数，ヘモグロビン量より算出)，平均赤血球ヘモグロビン濃度(ヘマトクリット値，ヘモグロビン量より算出)(以上，自動血球計数装置F-820，シスメックス)，網赤血球数(Brecher法)，白血球百分比(May-Gr殤wald-Giemsa染色)を測定した．また，3.8 %クエン酸ナトリウムで処理し，3000回転/分10分間の遠心分離により得られた血漿を用いて，プロトロンビン時間(トロンボプラスチン法)および活性化部分トロンボプラスチン時間(エラジン酸法)(以上，血液凝固自動測定装置アメルングKC-10A，バクスター)を測定した．

5)　血液生化学検査

全例について，血液学検査と同時に採血し，ヘパリンナトリウム処理後，3000 回転/分10分間の遠心分離により得られた血漿を用いて，GOT(IFCC法)，乳酸脱水素酵素(Wrblewski-La Due法)およびグルコース(ヘキソキナーゼ法)を測定し，分離剤入り試験管に血液を採取し，3000回転/分で10分間の遠心分離により得られた血清を用いて，GPT(IFCC法)，アルカリホスファターゼ(GSCC法)，γ-GTP(L-γ-グルタミル-3-カルボキシ-4-ニトロアニリド基質法)，総コレステロール(酵素法)，トリグリセリド(遊離グリセロール消去法)，総ビリルビン(アゾビリルビン法)，尿素窒素(ウレアーゼ・インドフェノール法)，クレアチニン(Jaff法)，カルシウム(OCPC法)，無機リン(Fiske-Subba Row法)，総蛋白(ビウレット法)(以上，自動分析装置7150形，日立製作所)，ナトリウムおよびカリウム(炎光光度法)(以上，自動炎光光度計480型，コーニング)，クロール(電量滴定法，クロライドカウンターCL-6M，平沼産業)，蛋白分画およびA/G比(セルロースアセテート膜電気泳動法，全自動電気泳動装置CTE-150，常光)を測定した．

6)　剖検および器官重量測定

全例について，投与28日あるいは回復14日の翌日に剖検した．剖検時には，体外表を観察し，エーテル麻酔下で採血後，放血致死させ，全身の器官・組織を肉眼的に観察した．また，電子式上皿天秤を用いて脳，肺，心臓，肝臓，腎臓，脾臓，副腎，下垂体，胸腺，甲状腺(上皮小体含む)，精巣，精巣上体，卵巣を固定する前に重量測定した．左右のある器官は左右併せて測定した．個々の器官の絶対重量を剖検当日に測定した体重で除し，100を乗じた相対重量を算出した．

7)　病理組織学検査

全例について剖検時に固定・保存した全器官・組織について，パラフィン包埋後薄切し，ヘマトキシリン・エオジン染色標本を作製して鏡検した．鏡検は対照群および300および400 mg/kg投与群の全例について行った．また，30および100 mg/kg投与群の雌雄全例について前胃，胃の境界縁，肝臓および腎臓の鏡検を行い，雌については胸腺の鏡検も行った．

5.　統計解析

投与期間中は，0，300および400 mg/kg投与群については回復群の動物も合わせて集計し，0 mg/kg投与群を対照として比較検定を行った．

体重，体重増加量および増加率，摂餌量，尿検査の定量的項目(尿比重を除く)，血液学検査(白血球百分比を除く)，血液生化学検査，器官の絶対および相対重量の成績についてBartlettの検定法によって等分散性を解析し，等分散の場合は一元配置分散分析法，不等分散の場合はKruskal-Wallisの検定法で解析した．一元配置分散分析の結果，有意差がみられた場合は，Dunnettの検定法を用いて，Kruskal-Wallis法の解析の結果，有意差がみられた場合は，Mann-WhitneyのU-検定法を用いてそれぞれ対照群との比較を行った．

尿検査の定性的項目，尿比重および白血球百分比の成績については，群毎の傾向をKruskal-Wallisの検定法で解析し，有意差がみられた場合はMann-WhitneyのU-検定法を用いて対照との比較を行った．なお，白血球百分比については毎の平均値および標準偏差も算出した．対照群との比較検定については，危険率5 %未満を統計学的に有意とした．

成績

1.　一般状態

投与期間中に100 mg/kg投与群の雄1例，300 mg/kg投与群の雄1例，雌3例，400 mg/kg投与群の雄5例，雌7例に外尿道口周囲被毛の汚れがみられ，300 mg/kg投与群の雌5例，400 mg/kg投与群の雌2例で流涎がみられた．回復期間中には各投与群の雌雄ともに異常は認められなかった．

2.　体重(Fig. 1)

投与期間中に雄の各投与群および雌の30および100 mg/kg投与群に有意差はみられなかったが，雌の300 mg/kg投与群で投与7および28日，雌の400 mg/kg投与群で投与7，14および28日に有意な低値が認められた．投与期間中の体重増加量および体重増加率でも，雌の300および400 mg/kg投与群で有意な低値が認められた．

回復期間中では，雄の300 mg/kg投与群で回復1日に有意な低値がみられたが，回復7日以降には有意差は認められなかった．同様に，雄の400 mg/kg投与群で回復1および7日に有意な低値がみられたが，回復14日には有意差は認められなかった．一方，雌の各投与群ともに有意差はみられず，回復期間中の体重増加量および体重増加率にも各投与群の雌雄ともに有意差は認められな かった．

3.　摂餌量(Fig. 2)

投与期間中に雄の各投与群および雌の30および100 mg/kg投与群に有意差はみられなかったが，雌の300 mg/kg投与群で投与7および28日，雌の400 mg/kg投与群で投与7，14および28日に有意な低値が認められた．

回復期間中には各投与群の雌雄ともに有意差は認められなかった．

4.　尿検査(Table 1, 2)

投与期間中に300 mg/kg投与群の雄で尿量の有意な高値，400 mg/kg投与群の雌雄でpHの有意な低下および尿量の有意な高値がみられ，雄では採尿中の飲水量に有意な高値，雌では尿比重の有意な低値も認められた．なお，30 mg/kg投与群の雌で尿量の有意な高値，100 mg/kg投与群の雌で尿沈渣中の扁平上皮の有意な増加がみられたが用量依存的な変化ではなかった．

回復期間中には各投与群の雌雄ともに有意な変化は認められなかった．

5.　血液学検査(Table 3, 4)

投与期間終了時の400 mg/kg投与群の雌で平均赤血球ヘモグロビン濃度の有意な低値および活性化部分トロンボプラスチン時間の有意な延長が認められた．なお，100 mg/kg投与群の雄で平均赤血球ヘモグロビン量の有意な低値がみられたが，関連する項目に変化がみられないことから被験物質の影響とは考えられなかった．

回復期間終了時の300および400 mg/kg投与群の雄で平均赤血球ヘモグロビン濃度の有意な低値が認められた．

6.　血液生化学検査(Table 5, 6)

投与期間終了時の300 mg/kg投与群の雌でγ-GTPの有意な高値が認められた．400 mg/kg投与群の雌雄ともにγ-GTPの有意な高値がみられ，雄でβ-グロブリン比の有意な高値，雌でα1-グロブリン比の有意な高値が認められた．

回復期間終了時の雌で各投与群にGPTの有意な低値が認められた．

7.　剖検

投与期間終了時の400 mg/kg投与群の雄3例に前胃粘膜の肥厚，雌1例に前胃粘膜の肥厚，盲腸の拡張と水様内容物，および脾臓と胸腺の萎縮が認められた．

回復期間終了時の各投与群の雌雄ともに異常所見は認められなかった．

8.　器官の絶対および相対重量(Table 7, 8)

投与期間終了時に300 mg/kg投与群の雄，400 mg/kg投与群の雌雄に肝臓の相対重量に有意な高値がみられ，400 mg/kg投与群の雄で腎臓の絶対重量の高値傾向および相対重量の有意な高値，雌で腎臓の絶対重量に有意な低値が認められた．また，雌では胸腺の絶対および相対重量の有意な低値がみられた．なお，400 mg/kg投与群の雌で卵巣の絶対重量の有意な低値および脳の相対重量の有意な高値もみられたが，剖検日体重に有意な低値が認められていることによるものと考えられた．30 mg/kg投与群の雄で腎臓の絶対および相対重量に有意な高値がみられたが，用量依存的な変化ではなかった．

回復期間終了時に300 mg/kg投与群の雄で精巣上体の絶対重量に有意な低値，雌で腎臓および肺の絶対重量に低値，400 mg/kg投与群の雌で肺および甲状腺の絶対重量に有意な低値がみられたが，投与終了時にはみられていない変化であり，被験物質投与との関連はないと考えられた．

9.　病理組織学検査

投与期間終了時の100 mg/kg投与群の雌1例の前胃，また雌雄各1例の胃の境界縁で軽度な扁平上皮過形成が認められた．300 mg/kg投与群の雄4例，雌5例全例で前胃の軽度または中等度な扁平上皮過形成がみられ，胃の境界縁でも雌雄各3例に軽度な扁平上皮過形成が認められた．400 mg/kg投与群の雌雄各5例全例で前胃の軽度または中等度な扁平上皮過形成がみられ，胃の境界縁でも雌雄各4例に軽度な扁平上皮過形成が認められた．400 mg/kg投与群の雄3例の腎臓に軽度な近位尿細管上皮の硝子滴および好酸性小体もみられ，雌1例に盲腸の軽度な粘膜固有層の水腫および脾臓と胸腺の萎縮，雄2例に前立腺のリンパ球浸潤も認められた．なお，30 mg/kg投与群の雌雄の前胃，胃の境界縁，肝臓および腎臓，100 mg/kg投与群の雌雄の肝臓および腎臓には変化はみられなかった．

回復期間終了時の300 mg/kg投与群の雌1例に軽度な前胃の扁平上皮過形成が認められた．300 mg/kg投与群の雄1例の肝臓で軽度な限局性壊死が認められた．400 mg/kg投与群の雄2例，雌4例で軽度な前胃の扁平上皮過形成が認められた．400 mg/kg投与群の雄の腎臓で軽度な近位尿細管上皮の硝子滴が1例，軽度な尿細管上皮の再生が2例，軽度な硝子円柱が1例，さらに軽度なリンパ球浸潤が1例に認められた．

考察

300および400 mg/kg投与群の雌雄で投与期間中に外尿道口周囲被毛の汚れが用量依存な例数の増加を伴ってみられ，雌では流涎も認められた．

体重および摂餌量では，300および400 mg/kg投与群の雌で投与7日以降に体重増加抑制がみられ，摂餌量にも低値が認められた．この体重増加抑制は投与期間中の体重増加量および増加率の有意差を伴うものであり，被験物質投与の影響と考えられた．

尿検査では，300 mg/kg投与群の雄および400 mg/kg投与群の雌雄に尿量の高値がみられ，400 mg/kg投与群では雌雄に尿pHの低下，雄で飲水量の高値，雌で尿比重の低値も認められた．これらの変化には相互に関連性がみられ，被験物質投与の影響と考えられた．

血液学検査では，400 mg/kg投与群の雌で平均赤血球ヘモグロビン濃度の低値および活性化部分トロンボプラスチン時間の延長がみられ，被験物質投与の影響と考えられた．一方，雄の300および400 mg/kg投与群で回復終了時に平均赤血球ヘモグロビン濃度の低値がみられ，雌と同様に被験物質投与の影響が遅れて発現したものと考えられた．

血液生化学検査では，300 mg/kgの投与群の雌および400 mg/kg投与群の雌雄でγ-GTPに高値，400 mg/kg投与群の雄でβ-グロブリン比の高値，雌でα1-グロブリン比の高値が認められた．これらの変化は被験物質投与の影響と考えられた．

剖検では，400 mg/kg投与群の雌雄で前胃粘膜の肥厚がみられ，本被験物質が粘膜に対する刺激性を有する1)ことから，被験物質の刺激性に起因するものと考えられた．また雌1例に盲腸の拡張と水様内容物および脾臓と胸腺の萎縮が認められた．この変化は一般状態における外尿道口周囲被毛の汚れや体重増加抑制等による全身状態の悪化に関連したものと考えられた．

器官重量では，300 mg/kg投与群の雄および400 mg/kg投与群の雌雄ともに肝臓の相対重量に高値，400 mg/kg投与群の雄では腎臓の絶対および相対重量に高値または高値傾向がみられ，いずれの変化も被験物質投与との関連が考えられた．また，400 mg/kg投与群の雌では胸腺の絶対および相対重量の有意な低値がみられ，剖検時に1例で胸腺の萎縮がみられていることからこの変化にも被験物質投与との関連が考えられた．

病理組織学検査では，剖検時には400 mg/kg投与群にのみ認められた前胃の肥厚に関連して，100 mg/kg以上の投与群の雌で前胃の扁平上皮過形成が，同様に100 mg/kg以上の投与群の雌雄で胃の境界縁における扁平上皮過形成が認められた．

400 mg/kg投与群の雄でみられた腎臓重量の高値に関連して，400 mg/kg投与群の雄にのみ腎臓の近位尿細管上皮に硝子滴および好酸性小体が認められた．300 mg/kg投与群の雌および400 mg/kg投与群の雌雄にみられた肝臓の相対重量の高値に関連する変化は認められず，その原因については明らかでなかった．

血液学検査における平均赤血球ヘモグロビン濃度の低値を除くいずれの変化も，休薬により回復あるいは回復傾向がみられ可逆性の変化と考えられた．

以上のことより，本試験条件下における4-(1-メチルエテニル)フェノールの無影響量(NOEL)は，雌雄ともに30 mg/kg/dayと考えられた．

文献

1)三井化学(株)社内資料．

連絡先
試験責任者：須永昌男
試験担当者：木口雅夫，咲間正志，笠原みゆき，平田真理子，古川正敏
(株)化合物安全性研究所
〒004-0839　札幌市清田区真栄363-24
Tel 011-885-5031Fax 011-885-5313

Correspondence
Authors:Masao Sunaga(Study director)
Masao Kiguchi, Masashi Sakuma, Miyuki Kasahara, Mariko Hirata, Masatoshi Furukawa
Safety Research Institute for Chemical Compounds Co., Ltd.
363-24 Shin-ei, Kiyota-ku, Sapporo-shi, Hokkaido, 004-0839, Japan
Tel +81-11-885-5031Fax +81-11-885-5313