では5000 μg/plateの用量で溶媒対照値の2倍に達したが，本試験
では溶媒対照値の2倍以上となる用量は認められなかった．そこで，再現性を確認するために本試験と同一用量で再現性試験を実施した(Table 3)．その結果，復帰変異コロニー数は用量依存的な増加を示したが，溶媒対照値の2倍には達しなかった．
検定菌として，Salmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA1537 1)およびEscherichia coli WP2 uvrA 2)の5菌株を用い，S9 mix無添加および添加試験のいずれも，用量設定試験で抗菌性が認められなかったことから，本試験はS9 mix無添加試験および添加試験ともに313〜5000 μg/plateの範囲で実施した．
その結果，2回の本試験ともTA1535のS9 mix無添加試験および添加試験において，復帰変異コロニー数が溶媒対照値の2倍以上に増加し，用量依存性が認められた．
以上の結果から，二酸化チオ尿素は，用いた試験系において変異原性を有するもの(陽性)と判定した．
S. typhimuriumの4菌株は1975年10月31日にアメリカ合衆国，カリフォルニア大学のB. N. Ames博士から分与された．
E. coli WP2 uvrA株は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与された．
検定菌は-80℃以下で凍結保存したものを用い，各菌株の特性確認は，凍結保存菌の調製時に，アミノ酸要求性，UV感受性，膜変異(rfa)およびアンピシリン耐性因子pKM 101(プラスミド)の有無について調べ，特性が維持されていることを確認した．
試験に際して，ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid Ltd.)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し，37℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした．
分光光度計により660 nmの吸光度を測定し，検定菌液の増殖を確認した．
二酸化チオ尿素は，45〜50℃で温浴しながら超音波洗滌器およびTHERMO MIXER®を用いて，局方注射用水(ロット番号:K6I94，(株)大塚製薬工場)に溶解して最高用量の調製液を調製した後，同溶媒で所定の濃度に希釈して速やかに試験に用いた．
| AF2 | : | 2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(和光純薬工業(株)) |
| SA | : | アジ化ナトリウム(和光純薬工業(株)) |
| 9AA | : | 9-アミノアクリジン(Sigma Chem. Co.) |
| 2AA | : | 2-アミノアントラセン(和光純薬工業(株)) |
AF2，9AAおよび2AAはDMSOに，SAは超純水に溶解したものを-20℃で凍結保存し，解凍後，速やかに試験に用いた．
| (A) | バクトアガー(Difco Lab.) | 0.6 w/v% |
| 塩化ナトリウム | 0.5 w/v% | |
| (B)* | L-ヒスチジン | 0.5 mM |
| D-ビオチン | 0.5 mM |
| * | : | WP2 uvrA用には，0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた． |
| 硫酸マグネシウム・7水和物 | 0.2 g |
| クエン酸・1水和物 | 2 g |
| リン酸水素二カリウム | 10 g |
| リン酸一アンモニウム | 1.92 g |
| 水酸化ナトリウム | 0.66 g |
| グルコース | 20 g |
| 大洋寒天(清水食品) | 15 g |
径90 mmのシャーレ1枚あたり30 mLを流して固めたものである．
| S9** | 0.1 mL |
| 塩化マグネシウム | 8 μmol |
| 塩化カリウム | 33 μmol |
| グルコース-6-リン酸 | 5 μmol |
| NADH | 4 μmol |
| NADPH | 4 μmol |
| ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4) | 100 μmol |
| ** | : | 7週齢のSprague-Dawley系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および5,6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製されたS9(キッコーマン(株))を用いた． |
小試験管中に，被験物質調製液0.1 mL，リン酸緩衝液0.5 mL(S9 mix添加試験においてはS9 mix 0.5 mL)，検定菌液0.1 mLを混合し，37℃で20分間プレインキュベーションしたのち，約45℃に保温したトップアガー2mLを加えて混和し，合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりに使用溶媒，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．各検定菌ごとに用いた陽性対照物質の名称および用量は各Table中に示した．同時に実施した試験については，溶媒および陽性対照群を共通とした．培養は37℃で48時間行い，生じた復帰変異コロニー数を目視またはコロニーアナライザーを用いて算定した．抗菌性の有無については，肉眼あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌叢の状態から判断した．用いた平板は用量設定試験においては，溶媒および陽性対照群では3枚ずつ，各用量については1枚ずつとした．また，本試験においては，両対照群および各用量につき，3枚ずつを用い，それぞれの平均値と標準偏差を求めた．用量設定試験は1回，本試験は2回実施し，結果の再現性を確認した．
したがって，本試験における最高用量は，S9 mix無添加試験および添加試験とも5000 μg/plateとした．
313〜5000 μg/plate の範囲で公比を2として2回の本試験を実施した(Table 1, 2)．その結果，TA1535のS9 mix無添加試験および添加試験では，2回の本試験とも復帰変異コロニー数の用量依存的な増加が認められ，625または1250 μg/plate以上の用量で溶媒対照値の2倍以上となった．WP2 uvrAのS9 mix添加試験でも2回の本試験とも復帰変異コロニー数の用量依存的な増加が認められ，本試験では5000 μg/plateの用量で溶媒対照値の2倍に達したが，本試験では溶媒対照値の2倍以上となる用量は認められなかった．そこで，再現性を確認するために本試験と同一用量で再現性試験を実施した(Table 3)．その結果，復帰変異コロニー数は用量依存的な増加を示したが，溶媒対照値の2倍には達しなかった．
WP2 uvrAのS9 mix無添加試験およびTA100，TA98 およびTA1537においては，溶媒対照値の2倍以上となる復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．
これらの結果から，本被験物質はTA1535のS9 mix無添加試験および添加試験において復帰変異を誘発するものと考えられる．本被験物質の最大比活性は34.4(本試験，S9 mix無添加の1250 μg/plate)で，同一条件下における陽性対照物質2-アミノアントラセンの値(1094000)の約30000分の1であった．
以上の結果に基づき，二酸化チオ尿素は，用いた試験系において変異原性を有するもの(陽性)と判定した．
なお，本被験物質はチャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験でも，S9 mix非存在下および存在下で染色体の構造異常を誘発し陽性であった4)．一方，本被験物質の類縁化合物であるチオ尿素では，細菌を用いる復帰変異試験およびチャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験で，ともに陰性の結果が報告されている5)．
| 1) | D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983). |
| 2) | S. Venitt, C. Crofton-Sleigh, "Evaluation of Short-Term Tests for Carcinogens," eds. by F. J. de Serres, J. Ashby, Elsevier, North-Holland, New York, 1981, pp. 351-360. |
| 3) | T. Matsushima, T. Sugimura, M. Nagao, T. Yahagi, A. Shirai, M. Sawamura, "Short-Term Test Systems for Detecting Carcinogens," eds. by K. H. Norpoth, R. C. Garner, Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 1980, pp. 273-285. |
| 4) | 厚生省生活衛生局企画課生活化学安全対策室監修，"化学物質毒性試験報告，"Vol. 7，化学物質点検推進連絡協議会，東京，1999, p. 597. |
| 5) | 石館基監修，"染色体異常試験データ集,"リアライズ社，東京，1983. |
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| 試験責任者： | 澁谷 徹 | ||
| 試験担当者： | 原 巧，川上久美子 | ||
| (財)食品薬品安全センター 秦野研究所 | |||
| 〒257-8523 神奈川県秦野市落合729-5 | |||
| Tel 0463-82-4751 | Fax 0463-82-9627 | ||
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| Authors: | Tohru Shibuya (Study Director) Takumi Hara, Kumiko Kawakami | |||
| Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center | ||||
| 729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257-8523, Japan | ||||
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