塩基性炭酸ニッケル(II) 四水和物について，細菌を用いる復帰変異試験を実施した．

　試験菌株として，Salmonella typhimurium (TA100，TA98，TA1535，TA1537)およびEscherichia coli (WP2 uvrA)の5菌株を用いた．用量設定試験においてはS9 mix無添加群および添加群の各試験菌株において8.19〜5000 μg/plateの8用量，本試験ではS9 mix無添加群およびS9 mix添加群の各試験菌株において156〜5000 μg/plateの6用量で試験を実施した．その結果，S9 mix添加群のTA1535株を除きいずれも復帰変異コロニーの増加は認められなかった．S9 mix添加群のTA1535株においては用量設定試験では復帰変異コロニー数の増加は認められなかったが，本試験においては陰性対照の2倍以上に増加した．従って，156〜5000 μg/plateの6用量で確認試験を実施したが，復帰変異コロニー数の明確な増加は認められなかった．これらの試験結果は，用量設定試験，本試験あるいは確認試験により再現性が確認された．

　以上の結果より，本試験条件下では塩基性炭酸ニッケル(II) 四水和物は，変異原性を有しない(陰性)と結論した．

1.　試験菌株

　細菌を用いる復帰変異試験に広く使用されていることから，試験菌株としてヒスチジン要求性のSalmonella typhimurium TA100，TA98，TA1535およびTA1537 1)ならびにトリプトファン要求性のEscherichia coli WP2 uvrA 2)の5種類の菌株を選択した．
ネズミチフス菌は昭和58年9月9日にカリフォルニア大学のAmes BN教授から，また，大腸菌については昭和58年3月16日に国立衛生試験所(現:国立医薬品食品衛生研究所)から分与を受けた．平成15年9月16日〜9月19日(用量設定試験および本試験)ならびに平成16年9月6日〜9月9日(確認試験)に菌株の特性検査を実施し，当該試験に用いた菌株が規定の特性を保持していることを確認した．

　各菌株の菌懸濁液はジメチルスルホキシド(DMSO，Merck)を添加した後，凍結保存用チューブに0.2 mLずつ分注した．これを液体窒素を用いて凍結し，超低温フリーザーに-80℃で保存した．

2.　培地の調製

1)　最少グルコース寒天平板培地(プレート)

　オリエンタル酵母工業製のテスメディアAN培地を購入し，試験に用いた．本プレートは，Vogel-Bonnerの最少培地Eを含む水溶液(0.02 %硫酸マグネシウム・7水塩，0.2 %クエン酸・1水塩，1 %リン酸二カリウム・無水塩，0.192 %リン酸一アンモニウム，0.066 %水酸化ナトリウム〔いずれも最終濃度〕)に2 %のグルコース(和光純薬工業)と1.1 %の寒天(伊那寒天BA-30A)を加え，径90 mmのシャーレに1枚当たり30 mLを分注したものである．

2)　トップアガー(軟寒天)

　塩化ナトリウム0.5 w/v%を含む0.6 w/v% Bacto- agar(BD Diagnostic Systems)水溶液10容量に対し，ネズミチフス菌を用いる試験の場合，0.5 mmol/L L-ヒスチジン(関東化学)-0.5 mmol/L D-ビオチン(関東化学)水溶液を1容量加え，大腸菌を用いる試験の場合，0.5 mmol/L L-トリプトファン(関東化学)水溶液を同じく1容量加え用いた．

3.　前培養条件

　内容量200 mLのバッフル付三角フラスコに2.5 w/v%ニュートリエントブロス(Nutrient Broth No.2，Oxoid)溶液を25 mL分注し，これに融解した菌懸濁液を50 μL接種した．ウォーターバスシェーカー(MM-10，タイテック)を用い，37℃の条件で8時間振盪(往復振盪:100回/分)培養し，菌濃度を確認した後試験に使用した．

4.　S9 mix

　製造後6ヵ月以内のキッコーマン製S9 mixを試験に使用した．S9 mix中のS9は誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague- Dawley系雄ラットの肝臓から調製されたものである．S9 mixの組成を以下に示す．

5.　被験物質

　被験物質の塩基性炭酸ニッケル(II) 四水和物(ロット番号:PKN2539)は純度94.7 %のうすい緑の粉末である．本剤は水，DMSOに不溶，酸に可溶である．和光純薬工業(大阪)から提供された被験物質を使用した．被験物質は，使用時まで室温，密閉で保管した．なお，他の試験機関(食品薬品安全センター秦野研究所)にて保管されていた同一ロットの被験物質について実施した品質分析の結果(平成17年1月15日付報告)，安定性に関して問題はなかった．

6.　被験物質液の調製

　試験の都度，純度換算および無水物換算を実施した被験物質を注射用水(大塚製薬工場)を用いて懸濁し，調製原液とした．調製原液を使用溶媒を用いて順次所定濃度に希釈した後，速やかに処理を行った．

7.　試験用量の設定

　8.19〜5000 μg/plateの8用量(公比2.5)を用いて用量設定試験を実施した．その結果，S9 mix無添加群および添加群の各試験菌株で，いずれの用量においても復帰変異コロニー数の明確な増加傾向は認められなかった．また，S9 mix無添加群のWP2 uvrA株の5000 μg/plateにおいて，試験菌株に対する生育阻害作用が観察された．被験物質処理時，S9 mix無添加群および添加群の128〜5000 μg/plateでうすい緑色の被験物質の残存物が認められた．コロニー数計測時，S9 mix無添加群および添加群のいずれの用量においても，析出等の特筆すべき変化は観察されなかった．

　従って，本試験ではS9 mix無添加群および添加群とも，すべての試験菌株において5000 μg/plateを最高用量とし，それぞれ6用量(公比2)を設定した．

　また，S9 mix添加群のTA1535株において，本試験との再現性を確認するために確認試験を実施し，本試験と同じ5000 μg/plateを最高用量とした6用量(公比2)を設定した．

8.　陽性対照物質

　陽性対照物質として下記に示した調製済み陽性対照物質溶液(オリエンタル酵母工業)を使用した．

9.　試験方法

　Amesらの原法 1)の改良法であるプレインキュベーション法に準じて，S9 mix無添加群および添加群それぞれについて試験を実施した．試験管に，使用溶媒，被験物質液あるいは陽性対照物質溶液を100 μL，次いでS9 mix無添加群の場合，0.1 mol/L ナトリウム・リン酸緩衝液(pH 7.4)を500 μL，S9 mix添加群の場合，S9 mixを500 μL添加し，さらに試験菌液100 μLを加え，37℃で20分間振盪培養(プレインキュベーション)した．培養終了後，あらかじめ45℃に保温したトップアガーを2 mL添加し，混合液をプレート上に重層した．37℃の条件で48時間各プレートを培養した後，被験物質の試験菌株に対する生育阻害作用を確認するため，実体顕微鏡(×40)を用いてプレート上の試験菌株の生育状態を観察した．次いで，復帰変異により生じたコロニーを計測した．計測に際してはコロニーアナライザー(CA-11，システムサイエンス)を用いた．各濃度につき3枚のプレートを使用した．

10.　結果の解析

　復帰変異コロニー数が溶媒対照の2倍以上に増加し，かつ，再現性あるいは被験物質の用量に依存性が認められた場合に，陽性と判定した．

　統計学的手法を用いた検定は実施しなかった．

結果および考察

　用量設定試験の結果をTable 1〜2に，本試験の結果をTable 3〜4に示した．塩基性炭酸ニッケル(II) 四水和物処理によって，S9 mix添加群のTA1535株を除きいずれも復帰変異コロニーの増加は認められなかった．S9 mix添加群のTA1535株については，用量設定試験では復帰変異コロニーの増加は認められなかったが，本試験の1250 μg/plateにおいてのみ，復帰変異コロニー数の増加が認められた．したがって，S9 mix添加群のTA1535株において，再現性を確認するため確認試験を実施し，結果をTable 5に示した．その結果，被験物質処理による復帰変異コロニー数の明確な増加傾向は認められなかった．生育阻害作用については，用量設定試験ではS9 mix無添加群のWP2 uvrA株の5000 μg/plate，本試験ではS9 mix無添加群のTA100株およびWP2 uvrA株の5000 μg/plateで観察された．なお，被験物質処理時，用量設定試験では128〜5000 μg/plate，本試験および確認試験では156〜5000 μg/plateでうすい緑色の被験物質の残存物が認められた．コロニー数計測時，S9 mix無添加群および添加群のいずれの用量においても析出等の特筆すべき変化は観察されなかった．

　一方，陽性対照物質は用量設定試験，本試験および確認試験，いずれもにおいても溶媒対照群の2倍以上の復帰変異コロニーを誘発した．

　以上の試験結果から，当該試験条件下において，塩基性炭酸ニッケル(II) 四水和物の微生物に対する遺伝子突然変異に関し，陰性と判定した．

　なお，本被験物質〔塩基性炭酸ニッケル(II) 四水和物〕の遺伝毒性についてRTECSでは，ハムスター卵巣に姉妹染色分体交換を誘発すると報告している3)が，発がん性の報告は現在までない．

　また，IARCではニッケル化合物の発がん性をグループ1(ヒトに対して発がん性がある)としている3)．類縁体であるスルファミン酸ニッケル，硫酸ニッケルおよび塩化ニッケルについては，細菌を用いた復帰突然変異試験で陰性 4)と報告されている．

連絡先
	試験責任者:	菊池正憲
	試験担当者:	嶋田佐和子，古屋有佳子， 夏目匡克，木下裕加，大野久実， 田中　仁，上田摩弥，赤星まゆみ， 仲村渠奈美子
	（財）食品農医薬品安全性評価センター
	〒437-1213　静岡県磐田市塩新田582-2
	Tel 0538-58-1266	Fax 0538-58-1393

Correspondence
	Authors:	Masanori Kikuchi (Study Director) Sawako Shimada, Yukako Furuya, Masakatsu Natsume, Yuka Kishita, Kumi Oono, Jin Tanaka, Maya Ueda, Mayumi Akahoshi, Namiko Nakandakari
	Biosafety Research Center, Foods, Drugs and Pesticides (An-pyo Center)
	582-2 Shioshinden, Iwata-shi, Shizuoka, 437-1213, Japan
	Tel +81-538-58-1266	Fax +81-538-58-1393