2-(2'-ヒドロキシ-3',5'-ジ-tert-ブチルフェニル)ベンゾトリアゾールの
チャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験

In Vitro Chromosomal Aberration Test of 2-(2'-Hydroxy-3',5'-di-tert-butylphenyl)
benzotriazole in Cultured Chinese Hamster Cells

要約

2-(2'-ヒドロキシ-3',5'-ジ-tert-ブチルフェニル)ベンゾトリアゾールの培養細胞に及ぼす細胞遺伝学的影響について，チャイニーズ・ハムスター培養細胞(CHL/IU)を用いて染色体異常試験を実施した．

S9 mix非存在下および存在下の短時間処理(6時間処理後18時間の回復時間)において，3.2 mg/mL(10 mmol/L)の濃度においても細胞増殖抑制は認められなかった．連続処理(24時間処理)でも3.2 mg/mLにおいて50 %を越える増殖抑制作用は認められなかった．従って，すべての処理群で3.2 mg/mLを最高濃度とし，公比2で4〜5濃度設定した．

染色体分析の結果，S9 mix非存在下および存在下における短時間処理ではいずれの群(0.80〜3.2 mg/mL)においても染色体の構造異常の誘発作用および倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．

短時間処理で陰性の結果が得られたため，連続処理を行った，その結果，いずれの群(0.80〜3.2 mg/mL)においても染色体の構造異常ならびに倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．

以上の結果より，本試験条件下で2-(2'-ヒドロキシ-3',5'-ジ-tert-ブチルフェニル)ベンゾトリアゾールは，染色体異常を誘発しない(陰性)と結論した．

方法

1.　細胞

CHL/IU細胞はチャイニーズ・ハムスター，肺由来で，リサーチ・リソースバンク(JCRB)から入手(1988年2月，入手時:継代4代，現在21代)した．解凍後は継代10代以内で試験に用いた．仔牛血清(CS，Cansera International Inc.)を10 vol%添加したイーグルMEM(日水製薬(株))培養液を用い，CO2インキュベーター(37 ℃，5 % CO2)内で培養した．

2.　S9 mix

S9(キッコーマン(株))は，フェノバルビタールと5,6-ベンゾフラボンを投与した雄Sprague-Dawley系ラットの肝臓から調製したものを購入した．S9 mixは処理培地に10 vol%添加し，各成分の最終濃度はS9 5 vol%，グルコース6リン酸(Sigma Chemical Co.)0.83 mmol/L，β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(オリエンタル酵母工業(株))0.67 mmol/L，MgCl2 0.83 mmol/L，KCl 5.5 mmol/L，HEPES緩衝液(pH7.2)0.67 mmol/Lとした．

3.　被験物質

2-(2'-ヒドロキシ-3',5'-ジ-tert-ブチルフェニル)ベンゾトリアゾール(ロット番号:S4-034-1，シプロ化成(株)(福井))は，純度100 %(水分0.01 %を含む)の淡黄色粉末固体であり，常温で安定で，室温で保管した．本物質は水，アセトンおよびDMSOに不溶(50 mg/mL未満)であった．被験物質原体は，試験後の分析によって試験期間中，室温で安定であったことが確認された．

4.　被験物質の調製

被験物質は用時調製して試験に用いた．媒体は0.5 w/v%カルボキシメチルセルロースナトリウム(CMC Na，ロット番号:WTH1105，和光純薬工業(株))水溶液を用いて原液を調製した．原液を媒体で順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を作製した．被験物質調製液は，すべての試験において培養液の10 vol%になるように加えた．

5.　培養条件

2 × 104個のCHL/IU細胞を，培養液5 mLを入れたディッシュ(径6 cm)に播き，CO2インキュベーター内で3日間培養した．その後，連続処理では，新鮮培地と交換後，被験物質を加え，24時間処理した．また，短時間処理では，S9 mix非存在下および存在下で6時間処理し，処理終了後新鮮な培養液でさらに18時間培養した．

6.　細胞増殖抑制試験

染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため，被験物質の細胞増殖に及ぼす影響を調べた．培養終了後，細胞を10 vol%ホルマリン水溶液で固定し，0.1 w/v%クリスタルバイオレット水溶液で染色した．被験物質のCHL/IU細胞に対する増殖抑制作用は，単層培養細胞密度計(Monocellatertm，オリンパス光学工業(株))を用いて各群の増殖度を計測し，被験物質処理群の媒体対照群に対する細胞増殖の比をもって指標とした．

その結果，S9 mix非存在下および存在下における短時間処理において最高処理濃度の3.2 mg/mL(10 mmol/L)においても細胞増殖抑制は認められなかった(Fig. 1)．連続処理においては弱い増殖抑制作用が認められたが，最高処理濃度の3.2 mg/mLの濃度においても50 %を越える増殖抑制作用は認められなかった(Fig. 1)．

7.　実験群の設定

細胞増殖抑制試験の結果より，染色体異常試験で用いる被験物質の高濃度群を，すべての処理群において3.2 mg/mL(10 mmol/L)を最高処理濃度とした．短時間処理では，公比2で4濃度群(0.40〜3.2 mg/mL)，連続処理では，公比2で5濃度群(0.20〜3.2 mg/mL)を設定した．

また，陽性対照物質として用いたマイトマイシンC(MC，協和醗酵工業(株))およびシクロホスファミド(CP，Sigma Chemical Co.)は，日局注射用水((株)大塚製薬工場)に溶解して調製した．それぞれ染色体異常を誘発することが知られている濃度を適用した．

染色体異常試験において，溶媒対照群と処理群では1濃度あたり4枚のディッシュを用いた．このうちの2枚で染色体標本を作製し，残りの2枚については単層培養細胞密度計により細胞増殖率を測定した．無処理対照群および陽性対照群については細胞増殖率測定は行わな かった．

8.　染色体標本作製法

培養終了の2時間前に，コルセミドを最終濃度が約0.1 μg/mLになるように培養液に加えた．染色体標本の作製は常法に従って行った．スライド標本は各ディッシュにつき6枚作製した．作製した標本は3 vol%ギムザ溶液で染色した．

9.　染色体分析

細胞増殖率測定の結果と分裂指数を細胞毒性の指標として，20 %以上の相対増殖率で，かつ2ディッシュともに0.5 %以上の分裂指数を示した最も高い濃度を観察対象の最高濃度群とし，観察対象の3濃度群を決定した．その結果(Table 1〜3)，すべての処理系列において観察可能な最高濃度は3.2 mg/mL(10 mmol/L)であったことから，この濃度を高濃度群として3濃度群を観察対象とした．

作製したスライド標本のうち，1つのディッシュから得られた異なるスライドを，4名の観察者がそれぞれ処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した．染色体の分析は，日本環境変異原学会・哺乳動物試験研究会(MMS)1)による分類法に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型のギャップ，切断，交換などの構造異常の有無と倍数性細胞(polyploid)の有無について観察した．また構造異常については1群200個，倍数性細胞については1群800個の分裂中期細胞を分析した．

10.　判定

染色体異常を有する細胞の出現頻度について，溶媒対照群と被験物質処理群および陽性対照群間でフィッシャーの直接確率法2)により，有意差検定を実施した(p<0.01)．また，用量依存性に関してコクラン・アーミテッジの傾向性検定3)(p<0.01)を行った．これらの検定結果を参考とし，生物学的な観点からの判断を加味して染色体異常誘発性の評価を行った．

結果および考察

2-(2'-ヒドロキシ-3',5'-ジ-tert-ブチルフェニル)ベンゾトリアゾールを加えてS9 mix非存在下および存在下で短時間処理した場合には，いずれの処理群(0.80，1.6，3.2 mg/mL)においても染色体の構造異常および倍数性細胞の有意な増加は認められなかった(Table 1, 2)．

短時間処理で陰性の結果が得られたため，24時間処理を行ったところ，いずれの群(0.80，1.6，3.2 mg/mL)においても染色体の構造異常ならびに倍数性細胞の誘発作用は認められなかった(Table 3)．

陽性対照物質として用いたMCは，S9 mix非存在下で短時間処理および24時間連続処理した場合において染色体の構造異常を誘発し(Table 1, 3)，CPはS9 mix存在下で短時間処理した場合において染色体の構造異常を誘発した(Table 2)．これらの陽性対照物質の結果より，本実験系の成立が確認された．

なお，2-(2'-ヒドロキシ-3',5'-ジ-tert-ブチルフェニル)ベンゾトリアゾールは，細菌を用いる復帰変異試験において陰性の結果が得られている4)．また関連物質である2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルフェノール(butylated hydroxytoluene)5)については復帰変異試験および染色体異常試験で陰性，ρ-tert-ブチルフェノール6, 7)，2-tert-ブチルフェノール8, 9)および2,4-ジ-tert-ブチルフェノール10, 11)については，復帰変異試験で陰性，染色体異常試験で陽性の結果が報告されている．これらのことから，tert-ブチルフェノールの染色体異常誘発活性が，他の置換基が結合することにより失われることが示唆された．

以上の結果より，2-(2'-ヒドロキシ-3',5'-ジ-tert-ブチルフェニル)ベンゾトリアゾールは，本試験条件下でCHL/IU細胞に染色体異常を誘発しないと結論した．

文献

1)日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編，"化学物質による染色体異常アトラス，"朝倉書店，東京，1988, pp. 16-37.
2)吉村功編，"毒性・薬効データの統計解析，事例研究によるアプローチ，"サイエンティスト社，東京，1987, pp. 76-78.
3)吉村功，大橋靖夫編，"毒性試験講座14，毒性試験データの統計解析，"地人書館，東京，1992, pp. 218-223.
4)原巧ら，化学物質毒性試験報告，10, 237(2003).
5)祖父尼俊雄　監修，"染色体異常試験データ集改定1998年版，"エル・アイ・シー，東京，1999, p. 92.
6)澁谷徹ら，化学物質毒性試験報告，4, 295(1996).
7)田中憲穂ら，化学物質毒性試験報告，4, 301(1996).
8)野田篤ら，化学物質毒性試験報告，8, 219(2001).
9)野田篤ら，化学物質毒性試験報告，8, 224(2001).
10)野田篤ら，化学物質毒性試験報告，8, 387(2001).
11)野田篤ら，化学物質毒性試験報告，8, 392(2001).

連絡先
試験責任者：山影康次
試験担当者：高橋俊孝，渡辺美香，中川ゆづき，橋本恵子，三枝克彦，加藤初美
(財)食品薬品安全センター秦野研究所
〒257-8523　神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Kohji Yamakage(Study director)
Toshitaka Takahashi, Mika Watanabe, Yuzuki Nakagawa, Keiko Hashimoto, Katsuhiko Saegusa, Hatsumi Kato
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257-8523, Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627