検定菌として，Salmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA15371)およびEscherichia coli WP2 uvrA2)の5菌株を用い，S9 mix無添加条件および添加条件のいずれも，用量設定試験で生育阻害が認められなかったことから，本試験はS9 mix無添加条件および添加条件ともに313〜5000 μg/plateの範囲で実施した．
その結果，用いた5種の検定菌のいずれの用量においても，陰性対照値の2倍以上となる復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．
以上の結果から2-(2'-ヒドロキシ-3',5'-ジ-tert-ブチルフェニル)ベンゾトリアゾールは，用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した．
2-(2'-ヒドロキシ-3',5'-ジ-tert-ブチルフェニル)ベンゾトリアゾールは，ジメチルスルホキシド(DMSO，ロット番号:SEG4422，和光純薬工業(株))に懸濁して最高用量の調製液を調製した後，同溶媒で所定の濃度に希釈して速やかに試験に用いた．調製時に，発熱，発泡，変色等の変化はみられなかった．
各検定菌ごとに用いた陽性対照物質は，当研究所で十分な蓄積データが得られている物質および用量とし，それぞれTable中に示した．
| AF-2 | : | 2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(和光純薬工業(株)) |
| SA | : | アジ化ナトリウム(和光純薬工業(株)) |
| 9AA | : | 9-アミノアクリジン(Sigma Chem. Co.) |
| 2AA | : | 2-アミノアントラセン(和光純薬工業(株)) |
AF2，9AAおよび2AAはDMSOに，SAは超純水に溶解したものを-20 ℃で凍結保存し，解凍後，速やかに試験に用いた．
S. typhimuriumの4菌株は1997年8月7日に，E. coli WP2 uvrA株は1997年4月9日に日本バイオアッセイ研究センターの松島泰次郎博士から分与された．
検定菌は-80 ℃で凍結保存したものを用い，各菌株の特性確認は凍結保存菌の調製時に，アミノ酸要求性，UV感受性，膜変異(rfa)，アンピシリン耐性因子pKM101(プラスミド)の有無および陰性対照群と陽性対照群の復帰変異コロニー数について調べ，特性が維持されていることを確認した．
試験に際して，ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid Ltd.)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し，37 ℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした．
分光光度計により660 nmの吸光度を測定し，検定菌液の増殖を確認した．
| 硫酸マグネシウム・7水和物 | 0.2 g |
| クエン酸・1水和物 | 2 g |
| リン酸水素二カリウム | 10 g |
| リン酸一アンモニウム | 1.92 g |
| 水酸化ナトリウム | 0.66 g |
| グルコース | 20 g |
| 大洋寒天(清水食品(株)) | 15 g |
径90 mmのシャーレ1枚あたり30 mLを流して固めたものである．
| (A) | バクトアガー(Difco Lab.) | 0.6 w/v% |
| 塩化ナトリウム | 0.5 w/v% | |
| (B) | Salmonella typhimurium用 | |
| L-ヒスチジン | 0.5 mmol/L | |
| D-ビオチン | 0.5 mmol/L | |
| (C) | Escherichia coli用 | |
| L-トリプトファン | 0.5 mmol/L | |
| S9* | 0.1 mL |
| 塩化マグネシウム | 8 μmol |
| 塩化カリウム | 33 μmol |
| グルコース-6-リン酸 | 5 μmol |
| NADH | 4 μmol |
| NADPH | 4 μmol |
| ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4) | 100 μmol |
| * | : | 7週齢のSprague-Dawley系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および5,6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製したS9(キッコーマン(株))を用いた． |
小試験管中に，被験物質調製液0.1 mL，0.1 mol/Lナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)0.5 mL(S9 mix添加条件においてはS9 mix 0.5 mL)，検定菌液0.1 mLを混合し，37 ℃で20分間プレインキュベーションしたのち，約45 ℃に保温したトップアガー2 mLを加えて混和し，合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりに使用溶媒，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．同時に実施した他試験については，陰性および陽性対照群を共通とした．
培養は37 ℃で48時間行い，発生した復帰変異コロ ニー数をコロニーアナライザーまたは目視によって算定した．被験物質に由来する沈澱の有無は，肉眼により確認した．また，生育阻害の有無については，肉眼あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌叢の状態から判断した．用いた平板は用量設定試験においては，陰性および陽性対照群では3枚ずつ，各用量については1枚ずつとした．また，本試験においては，両対照群および各用量につき，3枚ずつを用い，それぞれの平均値と標準偏差を求めた．
用量設定試験は1回，本試験は同一用量について2回実施し，結果の再現性の確認をした．
したがって，S9 mix無添加条件および添加条件とも最高用量を5000 μg/plateとして公比2で5用量を設定して2回の本試験を実施した(Table 1, 2)．その結果，2回の試験とも陰性対照値の2倍以上となる復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．
以上の結果に基づき，2-(2'-ヒドロキシ-3',5'-ジ-tert-ブチルフェニル)ベンゾトリアゾールは，用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した．
なお，2-(2'-ヒドロキシ-3',5'-ジ-tert-ブチルフェニル)ベンゾトリアゾールは，当研究所で本試験と並行して実施したチャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験でも陰性の結果が得られている4)．また，関連物質であるブチレーティドヒドロキシトルエン5)については，復帰変異試験および染色体異常試験で陰性の結果が，ρ-tert-ブチルフェノール6, 7)，2-tert-ブチルフェノール8, 9)および2,4-ジ-tert-ブチルフェノール10, 11)については，復帰変異試験で陰性の，染色体異常試験で陽性の結果が得られている．
| 1) | D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983). |
| 2) | M. H. L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures," eds. by B. J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp. 161-187. |
| 3) | T. Matsushima, T. Sugimura, M. Nagao, T. Yahagi, A. Shirai, M. Sawamura, "Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens," eds. by K. H. Norpoth, R. C. Garner, Springer, Berlin, 1980, pp. 273-285. |
| 4) | 田中憲穂，化学物質毒性試験報告，10, 242(2003). |
| 5) | 祖父尼俊雄監修"染色体異常試験データ集，"エル・アイ・シー，東京，1999, p. 92. |
| 6) | 澁谷徹，化学物質毒性試験報告，4, 295(1996). |
| 7) | 田中憲穂，化学物質毒性試験報告，4, 301(1996). |
| 8) | 野田篤，化学物質毒性試験報告，8, 219(2001). |
| 9) | 野田篤，化学物質毒性試験報告，8, 224(2001). |
| 10) | 野田篤，化学物質毒性試験報告，8, 387(2001). |
| 11) | 野田篤，化学物質毒性試験報告，8, 392(2001). |
| 連絡先 | |||
| 試験責任者： | 原 巧 | ||
| 試験担当者： | 須井 哉，三枝克彦，加藤初美 | ||
| (財)食品薬品安全センター秦野研究所 | |||
| 〒257-8523 秦野市落合729-5 | |||
| Tel 0463-82-4751 | Fax 0463-82-9627 | ||
| Correspondence | ||||
| Authors: | Takumi Hara(Study Director) Hajime Sui, Katsuhiko Saegusa, Hatsumi Kato | |||
| Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center | ||||
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