フタル酸ジヘプチルエステルの
細菌を用いる復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of Diheptyl phthalate on Bacteria

要約

OECD既存化学物質安全性点検に係わる毒性調査事業の一環として，フタル酸ジヘプチルエステルについてSalmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98, TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAを用いる復帰突然変異試験をプレインキュベーション法により実施した.

予備試験の結果，いずれの菌株にも抗菌性が認められなかったことから，本試験では S9 mix非共存下および共存下のいずれも，5000〜313 μg/プレートの公比2で5濃度を設定した．

本試験を 2回実施した結果, 被験物質の各濃度において誘発された復帰変異コロニー数は，いずれの菌株においても陰性対照値の2倍以上を示さなかった．また，抗菌性はS9 mixの有無によらずいずれの菌株も5000 μg/プレートまで認められなかった．従って，フタル酸ジヘプチルエステルの変異原性は，陰性と結論した.

方法

〔使用菌株〕

カリフォルニア大学 B. N. Ames教授より1983年5月27日に入手したSalmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537および東京大学医科学研究所 松島教授より1985年10月14日に入手したEscherichia coli WP2 uvrAの5菌株を用いた．各使用菌株は超低温槽で-80℃以下に凍結保存した．

試験に際して，各凍結菌株を融解後，その 20 μlをニュートリエントブロス(Oxoid Nutrient Broth No.2, Unipath社)25 gを1 lの精製水に溶解して作成した液体完全培地10 mlに接種し，37℃で8時間振盪培養した．培養終了後の菌懸濁液は菌濃度を測定した後，試験に使用した．

〔被験物質〕

フタル酸ジヘプチルエステル (CAS No.：3648-21-3，ロット番号：0008，純度：99.56%；新日本理化(株)製造，日本化学工業協会提供)は分子量362.48，融点-55℃，沸点235〜245℃/10 mmHgの無色透明液体であり，水，熱，光等に安定である．また，水にほとんど溶けず，DMSO，アセトン，芳香族炭化水素に易溶である．なお，本ロットについては試験期間中安定であることを確認した.

フタル酸ジヘプチルエステルはジメチルスルホキシド (DMSO，ロット番号：603E2089，純度：99.7%，関東化学(株))を用いて最高濃度(50 mg/ml)の溶液を調製した後, 同溶媒で公比2で希釈したものを用いた．なお，本試験の1回目に調製した最高および最低濃度の溶液について濃度分析を実施し，いずれも所定濃度の100±5%以内であることを確認した．

〔陽性対照物質〕

陽性対照物質として下記のものを用いた．
AF-2 ： 2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(純度：98.0%, 和光純薬工業(株))
NaN3 ： アジ化ナトリウム(純度：96.5%，和光純薬工業(株))
ENNG ： N-エチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(純度：99.0%, Sigma Chemical Co.)
9-AA ： 9-アミノアクリジン(純度：99%, Sigma Chemical Co.)
2-AA ： 2-アミノアントラセン(純度：95.0%，和光純薬工業(株))

NaN3は注射用水((株)大塚製薬工場)に，その他はDMSOに溶解したものを使用した.

〔培地およびS9 mixの組成〕

1)　トップアガー

アミノ酸水溶液として，精製水を用いて D-ビオチン，L-ヒスチジンおよびL-トリプトファンの0.5 mM混合水溶液を調製し，これをろ過滅菌後, 冷蔵庫に保管した．精製水100 mlに対して，粉末寒天(Bacto-Agar；Difco社) 0.6 g，塩化ナトリウム0.5 gの割合で加え，オートクレーブで滅菌し完全に溶解させた後, 上記のアミノ酸水溶液を1/10量加えて混和し，約45℃に保温した．

2)　最少グルコース寒天平板培地

クリメディア AM-N培地(日清製粉(株))を購入し，使用した．なお，培地1 lあたりの組成は下記のとおりである．
硫酸マグネシウム七水塩0.2 g
クエン酸一水塩 2 g
リン酸水素二カリウム無水塩10 g
リン酸−アンモニウム1.92 g
水酸化ナトリウム0.66 g
ブドウ糖20 g
寒天（OXOID Agar No.1)15 g

径 90 mmのシャーレ1枚あたり30 mlを流して固めてある．

3)　S9 mix

S9 mix 1 mlあたり以下の組成で調製し，使用時まで氷中に保存した．
S9*0.1 ml
塩化マグネシウム六水塩8 μmol
塩化カリウム33 μmol
D-グルコース6-リン酸5 μmol
bNADPH4 μmol
b-NADH4 μmol
ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)100 μmol
滅菌精製水残量

*：購入したS9(キッコーマン(株))を使用した．このS9は，7週齢の雄のSD系ラットにフェノバルビタールと5,6-ベンゾフラボンを併用投与して作製した肝ホモジネートの9000×g遠心上清分画である．

〔試験方法〕

試験はプレインキュベーション法で実施した．

試験管に被験物質溶液 0.1 mlを分注し，S9 mix 0.5 mlと菌懸濁液0.1 mlを加え，37℃で20分間振盪し，プレインキュベーションを行った．S9 mixを共存させない場合には，S9 mixの代わりに0.1 Mナトリウム−リン酸緩衝液(pH 7.4) 0.5 mlを加えた．プレインキュベーション後, トップアガー2 mlを上記の試験管に加えて混和し，最少グルコース寒天平板培地に重層した．重層したトップアガーが凝固した後，37℃で48時間培養し，復帰変異コロニー数を数えた．同時に実体顕微鏡を用いてバックグランドの菌の生育を観察し，被験物質による抗菌性の有無を調べた．予備試験は各濃度あたり1 枚のプレートを使用した．本試験は各濃度あたり3枚のプレートを用い，2回実施した．また，被験物質溶液の代わりに陰性対照物質(溶媒)および各菌株毎の陽性対照物質を用いて，被験物質群と同様の操作を行う対照群を設けた．

〔試験結果の判定基準〕

被験物質処理プレートにおける復帰変異コロニー数 (平均値)が陰性対照値の2倍以上を示し，明確な用量相関性および再現性が認められる場合に陽性と判定した．

結果および考察

〔予備試験〕

5000, 2500, 1250, 625, 313, 156, 78.1, 39.1 μg/プレートの濃度で実施したところ，S9 mix非共存下および共存下のいずれについても, すべての菌株で抗菌性が認められなかった．従って，S9 mix非共存下および共存下のいずれについても本試験では5000, 2500, 1250, 625, 313 μg/プレートの5濃度を設定した．

〔本試験〕

結果を Table 1, 2に示した．上記の濃度範囲で試験を実施したところ，2回の本試験とも各テスト菌株の復帰変異コロニー数は，S9 mix 非共存下および共存下のいずれにおいても，陰性(溶媒)対照値の2倍以上を示さなかった．また，抗菌性はS9 mixの有無によらずいずれの菌株も5000 μg/プレートまで認められなかった．S9 mix 非共存下および共存下の1250 μg/プレート以上の濃度で，沈殿物が認められた．

以上の結果から，フタル酸ジヘプチルエステルの変異原性は陰性と結論した．

参考文献

1)D. M. Maron and B. N. Ames, Mutatation Research, 113, 173-215 (1983).
2)M. H. L. Green and W. J. Muriel, Mutatation Research, 38, 3-32 (1976).

連絡先
試験責任者：西冨　保
試験担当者：水野文夫，榎本佳明，石毛裕子
藤代洋子，村田久美，鈴木美江
(株)三菱化学安全科学研究所　鹿島研究所
〒314-02　茨城県鹿島郡波崎町砂山14
Tel 0479-46-2871Fax 0479-46-2874

Correspondence
Authors:Tamotsu Nishitomi(Study director)
Fumio Mizuno, Yoshiaki Enomoto,
Yuko Ishige,Yoko Fujishiro,
Kumi Murata,Yoshie Suzuki
Mitsubishi Chemical Safety Institute Ltd., Kashima Laboratory
14 Sunayama, Hasaki-machi, Kashima-gun, Ibaraki, 314-02 Japan
Tel +81-479-46-2871Fax +81-479-46-2874