1,2,4-ベンゼントリカルボン酸トリス(2-エチルヘキシル)
エステルの細菌を用いる復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of Tris(2-ethylhexyl) 1,2,4-benzenetricarboxylate on Bacteria

要約

既存化学物質安全性調査事業の一環として， 1,2,4-ベンゼントリカルボン酸トリス(2-エチルヘキシル)エステルについて，細菌を用いる復帰突然変異試験をプレート法により実施し，陰性の結果を得た．

検定菌として， Salmonella typhimurium TA100, TA1535, TA98, TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAの5菌株を用い，S9 mix無添加および添加の条件でプレート法により用量設定試験を50～5000 μg/プレートの用量で実施したところ，いずれの検定菌においても，抗菌性は認められなかった．したがって，本試験は S9 mix無添加試験および添加試験を 313～5000 μg/プレートの範囲で用量を設定して実施した．

その結果， 2回の本試験とも，用いた検定菌のいずれについて，いずれの用量においても復帰変異コロニー数の増加は認められなかったことから，1,2,4-ベンゼントリカルボン酸トリス(2-エチルヘキシル)エステルは，用いた試験系において変異原性を有しない(陰性)と判定された．

方法

〔検定菌〕

Salmonella typhimurium TA100

Salmonella typhimurium TA1535

Escherichia coli WP2 uvrA

Salmonella typhimurium TA98

Salmonella typhimurium TA1537

S. typhimuriumの4菌株1)は1975年10月31日にアメリカ合衆国，カリフォルニア大学のB. N. Ames博士から分与を受けた．

E. coli WP2 uvrA 株2)は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた．

検定菌は -80℃以下で凍結保存したものを用い，ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し，37℃で10時間往復振とう培養した

〔被験物質〕

1,2,4-ベンゼントリカルボン酸トリス(2-エチルヘキシル)エステル(CAS No. 3319-31-1)は，分子量546.87の淡黄色透明液体である．試験には，大八化学工業(株)製〔ロット番号:N-60601，純度99.0％以上(不純物:不明)〕を，(社)日本化学工業協会から供与された，使用時まで室温遮光保管して用いた．

1,2,4-ベンゼントリカルボン酸トリス(2-エチルヘキシル)エステルは，アセトンに溶解性がよいことから，アセトンに50 mg/mlになるように溶解した後，同溶媒で公比約3ないし2で希釈し，速やかに試験に用いた．

試験の開始に先立って， 1,2,4-ベンゼントリカルボン酸トリス(2-エチルヘキシル)エステルのアセトン溶液中での安定性試験，および含量測定試験を実施した．安定性試験においては，低濃度(3.13 mg/ml)溶液は本試験Ⅰで調製したものについて，また高濃度(500 mg/ml)溶液は染色体異常試験で調製したものについて，室温遮光条件下で，安定性を調べた．その結果，調製4時間後における各濃度の平均含量は，ともに初期値(0時間)の平均値に対して，101％であった．また，含量測定試験を行った結果，調製液の濃度は，低濃度は91.4％，高濃度は91.7％であった．

〔陽性対照物質〕

用いた陽性対照物質およびその溶媒は以下のとおりである．

AF2	：	2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド (上野製薬(株))
SA	：	アジ化ナトリウム (和光純薬工業(株))
9AA	：	9-アミノアクリジン (Sigma Chem. Co.)
2AA	：	2-アミノアントラセン (和光純薬工業(株))

AF2, 2AAはジメチルスルホキシド(DMSO，和光純薬工業(株))に溶解したものを-20℃で凍結保存し，用時解凍した．9AA は DMSOに，SAは純水に溶解し，速やかに試験に用いた．

〔培地およびS9 mix の組成〕

1)　トップアガー

下記の水溶液 (A)および(B)を容量比10:1の割合で混合した．

(A)	バクトアガー (Difco) 塩化ナトリウム	0.6％ 0.5％
(B)	* L-ヒスチジン D-ビオチン	0.5 mM 0.5 mM

*:	WP2 uvrA 用には，0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた．

2)　合成培地

培地は，日清製粉 (株)製の最少寒天培地を用いた．なお，培地1 lあたりの組成は下記のとおりである．

硫酸マグネシウム・7水和物	0.2 g
クエン酸・1水和物	2 g
リン酸水素二カリウム	10 g
リン酸一アンモニウム	1.92 g
水酸化ナトリウム	0.66 g
グルコース	20 g
バクトアガー(Difco)	15 g

径 90 mmのシャーレ1枚あたり30 mlを流して固めてある．

3)　S9 mix

1 ml中下記の成分を含む

S9**	0.1 ml
塩化マグネシウム	8 μmol
塩化カリウム	33 μmol
グルコース-6-リン酸	5 μmol
NADH	4 μmol
NADPH	4 μmol
ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)	100 μmol

**:	7週齢のSprague-Dawley系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および5,6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製したS9を用いた．

〔試験方法〕

プレート法により， S9 mix無添加試験およびS9 mix 添加試験を行った．

小試験管中に，被験物質調製液 0.1 ml，リン酸緩衝液 0.5 ml(S9 mix 添加試験においてはS9 mix 0.5 ml)，検定菌液0.1 mlを混合したのちトップアガー2 mlを加えて混和し，合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりにアセトン，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量は各Table中に示した．培養は37℃で48時間行い，生じた変異コロニー数を算定した．抗菌性の有無については，肉眼的あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌膜の状態から判断した．

用いた平板は用量設定試験においては，溶媒および陽性対照群では 3枚ずつ，各用量については1枚ずつとした．また，本試験においては両対照群および各用量につき，3枚ずつを用い，それぞれの平均値と標準偏差を求めた．用量設定試験は1回，本試験は同一用量について2回実施し，結果の再現性の確認を行った

〔判定基準〕

用いた 5種の検定菌のうち，1種以上の検定菌のS9 mix無添加あるいはS9 mix添加条件において，被験物質を含有する平板上における変異コロニー数の平均値が，溶媒対照のそれに比べて2倍以上に増加し，かつ，その増加に再現性あるいは用量依存性が認められた場合に，当該被験物質は本試験系において変異原性を有する(陽性)と判定することとした．

結果および考察

〔用量設定試験〕

50～5000 μg/プレートの範囲で公比を約3として，試験を実施したところ，すべての検定菌においてS9 mix無添加試験および添加試験のいずれも抗菌性は認められなかった．

〔本試験〕

結果をそれぞれ Table 1，2に示した．1,2,4-ベンゼントリカルボン酸トリス(2-エチルヘキシル)エステルの用量を，S9 mix添加試験および添加試験でともに313～5000 μg/プレートの範囲で公比を2として試験を実施した．その結果，2回の試験のいずれも，用いた5種類の検定菌のS9 mix無添加試験および添加試験において，溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加は認められなかった．

以上の結果に基づき， 1,2,4-ベンゼントリカルボン酸トリス(2-エチルヘキシル)エステルは，用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した．

文献

1)	D. M. Maron, B. N. Ames, Mutation Res., 113, 173 (1983).
2)	M. H. L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures," eds. by B. J . Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp. 161-187.

連絡先

試験責任者：澁谷　徹

試験担当者：原　　巧，坂本京子，川上久美子，
清水ゆり，松木容彦，中込まどか，
飯田さやか

(財)食品薬品安全センター　秦野研究所

〒257　秦野市落合729-5

Tel 0463-82-4751 Fax 0463-82-9627

Correspondence

Authors: Tohru Shibuya (Study Director)
Takumi Hara, Kyoko Sakamoto,
Kumiko Kawakami, Yuri Shimizu,
Yasuhiko Matsuki, Madoka Nakagomi,
and Syaka Iida

Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center

729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa 257 Japan

Tel +81-463-82-4751 Fax +81-463-82-9627

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