2-(ジメチルアミノ)エチルメタクリラートの
チャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験

In Vitro Chromosomal Aberration Test of
2-(Dimetylamino)ethyl methacrylate on Cultured Chinese Hamster Cells

要約

2-(ジメチルアミノ)エチルメタクリラートの染色体異常誘発性の有無を検討するため，チャイニーズ・ハムスター肺由来の線維芽細胞株(CHL)を用いてin vitroにおける染色体異常試験を実施した．

染色体異常試験に用いる濃度を決定するため，細胞増殖抑制試験を行った結果，連続処理法の場合は，24時間および48時間処理でそれぞれ625および313 μg/mL以上，短時間処理法の場合は，S9 mix非存在および存在下でそれぞれ 800および1600 μg/mL以上の濃度で，50％を上回る細胞増殖抑制が認められた．したがって，染色体異常試験における濃度は，連続処理法の場合20, 39, 78, 156, 313および625 μg/mL，短時間処理法の場合200, 400, 600, 800, 1400および1600 μg/mLとした．

試験の結果，連続処理法では，24時間および48時間処理ともに最高濃度の625 μg/mL(出現頻度88.5および76.5％)で染色体構造異常細胞の有意な増加が認められた．短時間処理法においては，S9 mix非存在下で細胞に対する毒性のため観察可能な分裂中期像が認められなかった高濃度を除く200〜600 μg/mL(出現頻度6.5, 49.5, 87.5％)で，また，S9 mix存在下では，800〜1600 μg/mL(出現頻度13.5, 99.5, 100％)で濃度依存的な染色体構造異常細胞の有意な増加が認められた．

以上の成績から，本実験条件下において，2-(ジメチルアミノ)エチルメタクリラートは，CHL細胞に対し染色体異常を誘発する(陽性)と結論した．

方法

1.　試験細胞株

チャイニーズ・ハムスター肺由来の線維芽細胞株(CHL)〔国立医薬品食品衛生研究所　変異遺伝部(元:国立衛生試験所 変異原性部)から昭和60年1月13日入手〕を使用した．供試細胞は，浮遊細胞液に10％の割合でジメチルスルホキシド(DMSO，和光純薬工業)を添加し，液体窒素条件下で保存しておいたものを培養液に戻し，解凍後の継代数が6回までのものを使用した．

2.　培養液

Eagle-MEM粉末培地(Gibco Laboratories)を常法に従い調製し，これに非働化仔牛血清(Gibco Laboratories)を10％の割合で添加したものを用いた．

3.　培養条件

4×10^3個/mLの細胞を含む培養液5 mLをシャーレ(径6 cm，Becton Dickinson Co.)に加え，37℃のCO2インキュベーター(5％CO2)内で培養した．

連続処理法では，培養開始3日後に被験物質供試液を加え，24時間および48時間処理した．また，短時間処理法では，培養開始3日後にS9 mix非存在および存在下で6時間処理し，処理終了後，新鮮培養液でさらに18時間培養した．

4.　S9 mix

製造後6ヶ月以内の染色体異常試験用凍結S9 mix(キッコーマン)を購入し，使用した．S9は，誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製されたものである．

5.　被験物質

2-(ジメチルアミノ)エチルメタクリラート(ロット番号K609415，三洋化成工業提供)は，無色透明の液体で，水，DMSOおよびアセトンに可溶であり，分子式C8H15NO2，分子量157.24，純度99.9％〔不純物として，ハイドロキノンモノメチルエーテル2000 ppm(重合防止剤として添加)，ジメチルアミノエタノール 0.1％以下，メチルメタクリレート0.02％以下を含む〕の物質である．

実験終了後，被験物質提供元において残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．

6.　被験物質供試液の調製

溶媒に蒸留水(大塚製薬工場)を用い，被験物質を溶解して最高濃度の供試液(原液)を調製した．この原液の一部を溶媒で順次希釈して所定濃度の供試液を調製した．供試液は，用時調製し，そのシャーレ内への添加量は培養液量の10％(v/v)とした．

7.　細胞増殖抑制試験

染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため，被験物質の細胞増殖に及ぼす影響を調べた．0.1％クリスタルバイオレット水溶液で染色した細胞の密度を単層培養細胞密度計(Monocellater TM, オリンパス光学工業)を用いて測定し，溶媒対照群の細胞増殖率を100％とした時の各濃度群の細胞増殖率を求めた．

その結果(Appendix 1, 2)，連続処理法の場合は，24時間処理では625 μg/mL以上の濃度で50％を上回る細胞増殖抑制が認められ，50％細胞増殖抑制濃度は313〜625 μg/mL間にあるものと判断された．48時間処理では156 μg/mL濃度で50％細胞増殖抑制が認められ，313 μg/mL以上の濃度で50％を上回る細胞増殖抑制が認められた．短時間処理法の場合は，S9 mix非存在および存在下でそれぞれ800および1600 μg/mL以上の濃度で50％を上回る細胞増殖抑制が認められ，50％細胞増殖抑制濃度は，それぞれ600〜800 μg/mL間および 1400〜1600 μg/mL間にあるものと判断された．

Appendix 1
Cell growth inhibition test of CHL cells continuously treated with 2-(dimethylamino)ethyl methacrylate without S9 mix

Concentration
(μg/mL)		Average cell growth rate (％)
24-hour treatment48-hour treatment
0(Solvent)100100
7866.062.5
15661.550.0
31358.039.0
62526.520.5
125012.03.5
250010.03.0
50008.02.5

Appendix 2
Cell growth inhibition test of CHL cells treated with 2-(dimethylamino)ethyl methacrylate with and without S9 mix

Concentration
(μg/mL)		Average cell growth rate (％)
without S9 mixwith S9 mix
0(Solvent)100100
60056.581.0
80041.570.5
100028.070.5
120018.070.5
140016.557.5
160011.543.5
180017.533.0

8.　実験群の設定

細胞増殖抑制試験の結果から，染色体異常試験における被験物質の濃度は，50％細胞増殖抑制濃度の前後が含まれ，かつ3濃度以上のデータが得られることを考慮して，連続処理法では625 μg/mLを最高濃度とし，以下公比2で計6濃度を設定した．短時間処理法においては1600 μg/mL(約10 mM)を最高濃度とし，以下公比2で4濃度，並びにS9 mix非存在および存在下で50％をやや上回る細胞増殖率を示した600および1400 μg/mLも設定し，計6濃度とした．対照として，溶媒対照群と陽性対照群を設けた．

陽性対照として，連続処理法ではN-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG, Sigma Chemical Co.)を2.5 μg/mL，短時間処理法では3,4-benzo［a］pyrene(B［a］P, Sigma Chemical Co.)を10 μg/mLの濃度で用いた．陽性対照物質の溶媒には，いずれもDMSO(和光純薬工業)を使用した．

9.　染色体標本の作製

培養終了2時間前にコルセミド(Gibco Laboratories)を最終濃度として0.2 μg/mLとなるように添加した．トリプシン処理で細胞を剥離し，遠心分離により細胞を回収した．75 mM塩化カリウム水溶液で低張処理後，用時調製した冷却メタノール・酢酸(3:1)混合液で細胞を固定した．空気乾燥法で染色体標本を作製した後，1.4％ギムザ液で約15分間染色した．スライド標本は，各シャーレにつき3枚作製した．

10.　染色体の観察

各シャーレ当たり100個，すなわち，1濃度当たり2シャーレ，200個の分裂中期像を，総合倍率600倍の顕微鏡下で観察した．標本は全てコード化し，盲検法で観察を行った．染色体の分析は，日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会(MMS)による分類法１）に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型のギャップ，切断，交換などの構造異常と倍数性細胞(Polyploid)の有無について観察した．

11.　記録と判定

観察した細胞数，構造異常の種類と数および倍数性細胞の数について集計し，構造異常を有する細胞については，ギャップのみを有する細胞を含めた場合(+g)と含めない場合(-g)とに区別して記録した．

ギャップを含めた染色体構造異常細胞および倍数性細胞の出現頻度について，多試料c 2検定を行い有意差(有意水準5％以下)が認められた場合は，フィッシャーの直接確率法を用いて溶媒対照群と各濃度群との間の有意差検定(有意水準は多重性を考慮して，5％または1％を処理群の数で割ったものを用いた)を行った．

その結果，溶媒対照群と比較して，被験物質による染色体異常細胞の出現頻度が2濃度以上で有意に増加し，かつ濃度依存性あるいは再現性が認められた場合，陽性と判定した．

結果および考察

連続処理法による結果をTable 1に示した．24時間および48時間処理ともに，最高濃度の625 μg/mLでのみ染色体構造異常細胞の有意な増加(出現頻度88.5および76.5％)が認められた．倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．

短時間処理法による結果をTable 2に示した．S9 mix非存在下では，200〜600 μg/mLで濃度依存的かつ有意な染色体構造異常細胞の増加(出現頻度6.5, 49.5, 87.5％)が認められた．S9 mix存在下では，800〜1600 μg/mLで濃度依存的な染色体構造異常細胞の有意な増加(出現頻度13.5, 99.5,100％)が認められた．S9 mix非存在および存在下ともに，倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．なお，短時間処理法S9 mix非存在下の800 μg/mL以上の濃度では，被験物質の細胞に対する毒性のため，観察可能な分裂中期像が認められなかった．

以上の成績から，本実験条件下では，2-(ジメチルアミノ)エチルメタクリラートのCHL細胞に対する染色体異常誘発性は陽性と判定した．本試験結果は，CHL細胞において，染色体異常を有する細胞の出現頻度が10％以上を陽性とする生物学的判定基準２）からみても明らかに陽性を示すものであった．陽性結果が得られたため，D20値３）(分裂中期像の20％に異常を誘発させるために必要な被験物質の濃度)を算出したところ，連続処理法では妥当と考えられるD20値は得られず，短時間処理法において算出された0.19 mg/mLを本被験物質のD20値とした．

なお，類縁化合物である(ジメチルアミノ)エチルアクリラートの変異原性についてもCHL細胞を用いた染色体異常試験並びにSalmonella typhimuriumおよびEscherichia coliを用いた復帰突然変異試験で陽性４）と報告されており，エチルメタクリラートについては，S.typhimuriumを用いた復帰突然変異試験で陰性５），L5178Yマウスリンホーマ細胞を用いた染色体異常試験で陽性６），CHO細胞を用いた染色体異常試験では陰性７）および姉妹染色分体交換試験で陽性７）と報告されている．また，2-(ジメチルアミノ)エチル塩化物については，麦酒酵母菌を用いた復帰突然変異試験で陽性８）と報告されている．

文献

1)日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編，"化学物質による染色体異常アトラス,"朝倉書店，東京，1988，pp. 16-37．
2)石館 基 監修，"改定増補 染色体異常試験データ集，" エル・アイ・シー，東京，1987，p. 19．
3)厚生省生活衛生局企画課生活化学安全対策室 監修，　"化審法毒性試験法の解説 改訂版，"化学工業日報　社，東京，1992, pp.51-52.
4)厚生省生活衛生局企画課生活化学安全対策室 監修，"化学物質毒性試験報告 Vol. 5,"化学物質点検推進連絡協議会，東京，1997，pp. 595-604．
5)E. Zeiger，B. Anderson，S. Haworth，T. Lowlor，K. Mortelmans，W. Speck，Environ．Mutagen.，9(suppl. 9), 1(1987)．
6)M.M. Moore，A. Amtower，C.L. Doerr，K.H. Brock, K.L. Dearfield, Environ.. Mol. Mutagen., 11, 49(1988)．
7)"The Dictionary of Substances and their Effects，" Vol.4，eds. by M.L. Richardson，S. Gangolli，The Royal Society of Chemistry，Cambridge，1994，pp. 430-432．
8)F.K. Zimmermann，R.C. Borstel，E.S. Halle，J.M. Parry，D. Siebert，G. Zetterberg，R. Barale，　　N. Loprieno，Mutat. Res.，133，199(1984)．

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試験責任者：野田　篤
試験担当者：野田　篤，昆　尚美
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