2-(ジメチルアミノ)エチルメタクリラートの細菌を用いる
復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of 2-(Dimetylamino)ethyl methacrylate on Bacteria

要約

2-(ジメチルアミノ)エチルメタクリラートの遺伝子突然変異誘発性の有無を検討するため，細菌を用いる復帰突然変異試験を実施した．

試験は，指標菌株としてSalmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAを用い，S9 mix非存在(直接法)および存在(代謝活性化法)下でプレインキュベーション法により行った．

156〜5000 μg/プレートの範囲で濃度を設定して行った濃度設定試験では，直接法におけるTA98およびTA1537の5000 μg/プレートでのみ菌の生育阻害が認められ，2500 μg/プレートでは，両菌株とも復帰変異コロニー数の増加が認められた．したがって，本試験は，いずれの菌株においても5000 μg/プレートを最高濃度とし，以下公比2で計6濃度を設定して行った．

試験を2回行った結果，直接法のTA1537においてのみ2500 μg/プレートで復帰変異コロニー数の増加が認められた．しかし，濃度依存性については明らかではなかった．また，直接法のTA98において，2500 μg/プレート以上の濃度で復帰変異コロニー数の増加傾向が認められた．

そこで，この2菌株について，1000〜5000 μg/プレートの範囲で濃度を設定(公差500)し，直接法における確認試験を行った．その結果，両菌株とも3500 μg/プレート以上の濃度で生育阻害が認められた．TA1537では2500および3000 μg/プレートで復帰変異コロニー数の増加が認められ，濃度依存性傾向も認められた．TA98では，復帰変異コロニー数の増加傾向は認められたものの，溶媒対照値の2倍を越えるものではなかった．

以上の成績から，本実験条件下では，2-(ジメチルアミノ)エチルメタクリラートは，細菌に対し遺伝子突然変異を誘発する(陽性)と結論した．

方法

1.　指標菌株

国立公衆衛生院地域環境衛生学部から1994年12月19日に分与を受けたS. typhimurium TA98，TA100，TA1535，TA1537１）およびE. coli WP2uvrA２）の5菌株を用いた．各菌株は，超低温槽で-80℃以下に凍結保存した．

試験に際して，各凍結菌株を解凍後，その30 μLをニュートリエントブロス(Bacto nutrient broth dehydrated，Difco Laboratories)液体培地15 mLに接種し，37℃で12時間振盪培養した．培養後の菌懸濁液は，濁度を測定し，濁度と生菌数の換算式より1 mLあたり1×10 9 以上の生菌数が得られていることを確認し，試験菌液とした．

各菌株の遺伝的特性検査は，凍結保存菌の調製時並びに各実験ごとに行い，本試験に用いた菌株が規定の特性を保持していることを確認した．

2.　被験物質

2-(ジメチルアミノ)エチルメタクリラート(ロット番号K609415，三洋化成工業提供)は，無色透明の液体で，水，ジメチルスルホキシド(DMSO)およびアセトンに可溶であり，分子式C8H15NO2，分子量157.24，純度99.9％〔不純物として，ハイドロキノンモノメチルエーテル2000ppm(重合防止剤として添加)，ジメチルアミノエタノール0.1％以下，メチルメタクリレート0.02％以下を含む〕の物質である．

実験終了後，被験物質提供元において残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．

3.　被験物質供試液の調製

溶媒に蒸留水(大塚製薬工場)を用い，被験物質を溶解して最高濃度の供試液(原液)を調製した．この原液の一部を溶媒で順次希釈して所定濃度の供試液を調製した．供試液は，用時調製した．

4.　陽性対照物質

陽性対照物質として下記のものを使用した．

AF-2:2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(和光純薬工業)
2-AA:2-アミノアントラセン(和光純薬工業)
SA　:アジ化ナトリウム(和光純薬工業)
9-AA:9-アミノアクリジン(Aldrich Chemical Co.)

AF-2および2-AAはDMSO(同仁化学研究所)に，SAおよび9-AAは蒸留水(大塚製薬工場)に溶解した．

5.　培地

1)　最少グルコース寒天平板培地(プレート)

テスメディアAN培地(オリエンタル酵母工業)を購入し，使用した．培地1 Lあたりの組成は下記のとおりであり，径90 mmのシャーレ1枚あたりに30 mLを分注したものである．

硫酸マグネシウム・七水塩0.2 g
クエン酸・一水塩2 g
リン酸水素二カリウム10 g
リン酸一アンモニウム1.92 g
水酸化ナトリウム0.66 g
グルコース20 g
寒天(OXOID Agar No.1)15 g

2)　アミノ酸添加軟寒天培地(トップアガー)

0.6％寒天粉末(Difco Laboratories)および0.5％塩化ナトリウムの組成の軟寒天を調製し，これに，S. typhimurium用には0.5 mM D-ビオチンおよび0.5 mM L-ヒスチジン水溶液，E. coli用には0.5 mM L-トリプトファン水溶液を1/10容加え，トップアガーとした．

6.　S9 mix

製造後6ヶ月以内のエームステスト用凍結S9 mix(キッコーマン)を購入し，使用した．S9は，誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製されたものである．

7.　試験方法

試験は，プレインキュベーション法で行った．

試験管に使用溶媒，被験物質供試液あるいは陽性対照物質溶液を0.1 mL入れ，次いで直接法では0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)を0.5 mL，代謝活性化法ではS9 mixを0.5 mL加え，続いて試験菌液0.1 mLを分注し，37℃で20分間振盪培養した．培養終了後，45℃に保温したトップアガー2 mLを加えた混合液をプレート上に重層した．37℃で48時間培養後，復帰変異コロニーを計数し，同時に指標菌株の生育阻害の有無を実体顕微鏡を用いて観察した．プレートは，濃度設定試験では各濃度とも2枚,本試験では3枚を使用した．本試験は，同一濃度を用いて2回行った．

8.　結果の判定

結果の判定は，各濃度におけるプレートでの復帰変異コロニー数の平均値を基に，以下の3基準を全て満たす場合を陽性とした．

1)被験物質処理群において溶媒対照値の2倍以上の復帰変異コロニー数が出現する．
2)被験物質濃度の増加とともに復帰変異コロニー数が増加する(濃度依存性)．
3)2回にわたる本試験の結果から，復帰変異コロニー数の増加に再現性が認められる．

結果および考察

156〜5000 μg/プレートの範囲で濃度を設定して行った濃度設定試験では，直接法におけるTA98およびTA1537の5000 μg/プレートでのみ菌の生育阻害が認められ，また，2500 μg/プレートでは両菌株とも溶媒対照と比較して2倍以上の復帰変異コロニー数の増加が認められた．したがって，本試験における被験物質の処理濃度は，最高濃度を5000 μg/プレートとし，以下公比2で2500, 1250，625，313および156 μg/プレートとした．

本試験の結果(Tables 1〜4)，直接法のTA1537株においてのみ2500 μg/プレートで溶媒対照値の2倍を越える復帰変異コロニー数の増加が認められたが，濃度依存性については明らかではなかった．また，直接法におけるTA98の2500 μg/プレート以上の濃度で復帰変異コロニー数の増加傾向が認められた．菌の生育阻害は，濃度設定試験と同様，TA98およびTA1537の5000 μg/プレートでのみ認められた．

そこで，この2菌株について2500 μg/プレートから菌の生育阻害が認められた5000 μg/プレート間に濃度依存性の復帰変異コロニー数の増加が認められるか否かを調べる目的で1000〜5000 μg/プレートの範囲で濃度を設定(公差500)し，直接法による確認試験を行った．その結果(Table 5)，両菌株とも3500 μg/プレート以上の濃度で生育阻害が認められた．TA1537では，2500および3000 μg/プレートで溶媒対照値と比較して2倍以上の復帰変異コロニー数の増加が認められ，濃度依存性傾向も認められた．TA98においては，2000〜3500 μg/プレートで復帰変異コロニー数の増加傾向が認められたものの，溶媒対照値の2倍を越えるものではなかった．

以上の成績から，本実験条件下では，2-(ジメチルアミノ)エチルメタクリラートの遺伝子突然変異誘発性は陽性と判定した．陽性結果が得られたので，変異原性の強さに関する相対的比較値である比変異活性値３）(誘発復帰変異コロニー数/mg)を算出したところ，本被験物質の比変異活性値は3.6/mgであった．

なお，類縁化合物である(ジメチルアミノ)エチルアクリラートの変異原性についても，S. typhimuriumおよびE. coliを用いた復帰突然変異試験並びにCHL細胞を用いた染色体異常試験で陽性４）と報告されており，エチルメタクリラートについては，S. typhimuriumを用いた復帰突然変異試験で陰性５），L5178Yマウスリンホーマ細胞を用いた染色体異常試験で陽性６），CHO細胞を用いた染色体異常試験では陰性７）および姉妹染色分体交換試験で陽性７）と報告されている．また，2-(ジメチルアミノ)エチル塩化物については，麦酒酵母菌を用いた復帰突然変異試験で陽性８）と報告されている．

文献

1)D.M. Maron，B.N. Ames，Mutat. Res.，113，173(1983)．
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3)厚生省生活衛生局企画課生活化学安全対策室 監修，"化審法毒性試験法の解説 改訂版，"化学工業日報社，東京，1992，p. 42．
4)厚生省生活衛生局企画課生活化学安全対策室 監修，"化学物質毒性試験報告 Vol. 5"化学物質点検推進連絡協議会，東京，1997，pp. 595-604．
5)E. Zeiger，B. Anderson，S. Haworth，T. Lowlor, K. Mortelmans，W. Speck，Environ．Mutagen.，9(suppl. 9)，1(1987)．
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7)"The Dictionary of Substances and their Effects，"Vol.4，eds. by M.L. Richardson，S. Gangolli，The Royal Society of Chemistry，Cambridge，1994，pp. 430-432．
8)F.K. Zimmermann，R.C. Borstel，E.S. Halle， J.M. Parry，D. Siebert，G. Zetterberg，R. Barale，　　N. Loprieno, Mutat. Res., 133, 199(1984)．

連絡先
試験責任者：野田　篤
試験担当者：野田　篤，昆　尚美
(財)畜産生物科学安全研究所
〒229-1132　神奈川県相模原市橋本台3-7-11
Tel 042-762-2775Fax 042-762-7979

Correspondence
Authors:Atsushi Noda(Study director)
Naomi Kon
Research Institute for Animal Science in Biochemistry and Toxicology
3-7-11 Hashimotodai, Sagamihara-shi, kanagawa, 229-1132, Japan
Tel +81-42-762-2775Fax +81-42-762-7979