S9 mix非存在下および存在下で短時間処理(6時間処理後 18時間の回復時間)において,5.0 mg/mLにおいても細胞増殖抑制は認められなかった.また,連続処理(24時間処理)した場合,50 %増殖抑制濃度は4.3 mg/mLとなった.このことから染色体異常試験では,すべての処理群において,5.0 mg/mLの濃度を最高処理濃度とし,短時間処理では公比2で計4濃度,連続処理では公比2で計5濃度を設定した.
細胞増殖率および分裂指数より,すべての処理群で1.3,2.5,5.0 mg/mLの濃度群について染色体分析を行った.
染色体分析の結果,S9 mix非存在下および存在下で短時間処理した場合,いずれの処理群においても染色体の構造異常の誘発は認められなかった.倍数性細胞については,S9 mix非存在下で短時間処理した2.5 mg/mL(中濃度群)および5.0 mg/mL(高濃度群)で有意に増加が認められた(1.1 %および3.4 %).S9 mix存在下で短時間処理した場合は,傾向性検定では有意差が認められたが,いずれの濃度群においても倍数性細胞は,陰性対照と比較して,有意差は認められなかった.
連続処理では,いずれの処理群においても,構造異常の誘発は認められなかった.倍数性細胞については,濃度に依存してその出現率が増加した(1.0-3.1 %)ことから,倍数性細胞を誘発すると判定した.
以上の結果より,本試験条件下で1,3,5-トリス(3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシベンジル)イソシアヌル酸は,染色体異常は誘発しないが,倍数性細胞は誘発する(陽性)と結論した.
その結果,S9 mix非存在下および存在下の短時間処理では,5.0 mg/mLにおいても,増殖抑制作用は認められなかった.一方,連続処理における50 %細胞増殖抑制濃度は4.3 mg/mLとなった(Fig. 1).
また,陽性対照物質として用いたマイトマイシンC(MMC,協和醗酵工業)およびシクロホスファミド(CP,Sigma Chemical)は,日局注射用水(大塚製薬工場)に溶解して調製した.それぞれ染色体異常を誘発することが知られている濃度を適用した.
染色体異常試験において,溶媒対照群と処理群では1濃度あたり4枚のディッシュを用いた.このうちの2枚は染色体標本を作製し,残りの2枚については単層培養細胞密度計により細胞増殖率を測定した.無処理対照群および陽性対照群については細胞増殖率測定は行わなかった.
作製したスライド標本のうち,1つのディッシュから得られた異なるスライドを,4名の観察者がそれぞれ処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した.染色体の分析は,日本環境変異原学会・哺乳動物試験研究会(MMS)1)による分類法に基づいて行い,染色体型あるいは染色分体型のギャップ,切断,交換などの構造異常の有無と倍数性細胞(polyploid)の有無について観察した.また構造異常については1群200個,倍数性細胞については1群800個の分裂中期細胞を分析した.
24時間連続処理においては,いずれの処理群においても染色体の構造異常は認められなかった.倍数性細胞については,濃度に依存した出現率の増加(1.0〜3.1 %)が認められ,陽性の結果が得られた(Table 3).
以上の結果から,倍数性が陽性と判定されたS9 mix非存在下の短時間処理および24時間連続処理群についてD20値を求めたところ,それぞれ30 mg/mL,および33 mg/mLとなった.
陽性対照物質として用いたMMCは,S9 mix非存在下で短時間処理および24時間連続処理した場合において染色体の構造異常を誘発し(Table 1,2),CPはS9 mix存在下で短時間処理した場合において染色体の構造異常を誘発した(Table 3).これらの陽性対照物質の結果より,本実験系の成立が確認された.
なお,被験物質は,細菌を用いる復帰変異試験で陰性の結果が得られている5).また,関連物質である1,3,5-トリス(2-プロペニル)イソシアヌル酸(trially isocyanurate)については染色体異常で代謝活性化された場合に,構造異常および倍数性細胞とも陽性と報告されているが6),当該試験と並行して実施した染色体異常試験では陰性の結果が得られている5).また,butylated bydroxytolueneについては,染色体異常試験で陰性の結果が報告されている6).
以上の結果より,1,3,5-トリス(3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシベンジル)イソシアヌル酸は,本試験条件下でCHL/IU細胞に染色体異常は誘発しないが,倍数性細胞は弱いながらも誘発すると結論した.
1) | 日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会(編):「化学物質による染色体異常アトラス」朝倉書店,東京 (1988) pp. 16-37. |
2) | 吉村 功(編):「毒性・薬効データの統計解析,事例研究によるアプローチ」サイエンティスト,東京 (1987) pp. 76-78. |
3) | 吉村 功,大橋靖夫(編):「毒性試験講座14,毒性試験データの統計解析」地人書館,東京 (1992) pp. 218-223. |
4) | 石館 基(監修)「<改定> 染色体異常試験データ集」エル・アイ・シー,東京 (1987) p. 23. |
5) | 原 巧 ら:1,3,5-トリス (3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシベンジル) イソシアヌル酸の細菌を用いる復帰変異試験.化学物質毒性試験報告,11:501-505 (2004). |
6) | 祖父尼俊雄(監修):「染色体異常試験データ集」改定1998年版,エル・アイ・シー,東京 (1999) pp. 449-500. |
連絡先 | |||
試験責任者: | 田中憲穂 | ||
試験担当者: | 山影康次,高橋俊孝,若栗 忍, 中川ゆづき,橋本恵子,三枝克彦, 加藤初美 | ||
(財)食品薬品安全センター秦野研究所 | |||
〒257-8523 神奈川県秦野市落合729-5 | |||
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Correspondence | ||||
Authors: | Noriho Tanaka(Study director) Kohji Yamakage, Toshitaka Takahashi, Shinobu Wakuri, Yuzuki Nakagawa, Keiko Hashimoto, Katsuhiko Saegusa, Hatsumi Kato | |||
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center | ||||
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