1,3,5-トリス(3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシベンジル)イソシアヌル酸の
チャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験

In Vitro Chromosomal Aberration Test of 1,3,5-Tris(3,5-di-tert-butyl-4-
hydroxybenzyl)isocyanuric acid in Cultured Chinese Hamster Cells

要約

1,3,5-トリス(3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシベンジル)イソシアヌル酸の培養細胞に及ぼす細胞遺伝学的影響について，チャイニーズ・ハムスター培養細胞(CHL/IU)を用いて染色体異常試験を実施した．

S9 mix非存在下および存在下で短時間処理(6時間処理後 18時間の回復時間)において，5.0 mg/mLにおいても細胞増殖抑制は認められなかった．また，連続処理(24時間処理)した場合，50 %増殖抑制濃度は4.3 mg/mLとなった．このことから染色体異常試験では，すべての処理群において，5.0 mg/mLの濃度を最高処理濃度とし，短時間処理では公比2で計4濃度，連続処理では公比2で計5濃度を設定した．

細胞増殖率および分裂指数より，すべての処理群で1.3，2.5，5.0 mg/mLの濃度群について染色体分析を行った．

染色体分析の結果，S9 mix非存在下および存在下で短時間処理した場合，いずれの処理群においても染色体の構造異常の誘発は認められなかった．倍数性細胞については，S9 mix非存在下で短時間処理した2.5 mg/mL(中濃度群)および5.0 mg/mL(高濃度群)で有意に増加が認められた(1.1 %および3.4 %)．S9 mix存在下で短時間処理した場合は，傾向性検定では有意差が認められたが，いずれの濃度群においても倍数性細胞は，陰性対照と比較して，有意差は認められなかった．

連続処理では，いずれの処理群においても，構造異常の誘発は認められなかった．倍数性細胞については，濃度に依存してその出現率が増加した(1.0-3.1 %)ことから，倍数性細胞を誘発すると判定した．

以上の結果より，本試験条件下で1,3,5-トリス(3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシベンジル)イソシアヌル酸は，染色体異常は誘発しないが，倍数性細胞は誘発する(陽性)と結論した．

方法

1.　細胞

CHL/IU 細胞はチャイニーズ・ハムスター，肺由来で，リサーチ・リソースバンク(JCRB)から入手(1988年2月，入手時:継代4代，現在21および23代)した．試験には，解凍後継代10代以内で試験に用いた．仔牛血清(CS，Cansera International)を10 vol%添加したイーグル MEM(日水製薬)培養液を用い，CO2 インキュベーター(37℃ ，5 % CO2)内で培養した．

2.　S9 mix

S9(キッコーマン)は，フェノバルビタールと5,6-ベンゾフラボンを投与した雄Sprague-Dawley系ラットの肝臓から調製したものを購入した．S9 mixは処理培地に10 vol%添加し，各成分の最終濃度はS9 5 vol%，グルコース6リン酸(Sigma Chemical)0.83 mmol/L，β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(オリエンタル酵母工業)0.67 mmol/L，MgCl2 0.83 mmol/L，KCl 5.5 mmol/L，HEPES 緩衝液(pH 7.2)0.67 mmol/Lとした．

3.　被験物質

1,3,5-トリス(3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシベンジル)イソシアヌル酸(ロット番号:10970，旭電化工業 (東京))は，純度100 %の白色粉末であり，密閉し，冷暗所で保管した．本物質は水，およびDMSOに対しては50 mg/mL未満の溶解性を示し，アセトンには255 mg/mL以上510 mg/mL未満の溶解性を示した．被験物質原体は，試験後の分析によって試験期間中，安定であったことが確認された．

4.　被験物質の調製

被験物質は用時調製して試験に用いた．媒体は0.5 %カルボキシメチルセルロースナトリウム(CMC Na，ロット番号:WTH1105，和光純薬工業)水溶液を用いて原液を調製した．ついで原液を媒体で順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を作製した．被験物質調製液は，すべての試験において培養液の10 vol%になるように加えた．なお，被験物質を媒体に懸濁させた際，発熱，発泡，変色などの変化はなく，懸濁性は良好であった．

5.　培養条件

2×104個のCHL/IU細胞を，培養液5 mLを入れたディッシュ(径6 cm)に播き，CO2インキュベーター内で3日間培養した．その後，連続処理では，新鮮培地と交換後，被験物質を加え，24時間処理した．また，短時間処理では，血清入りの培地によりS9 mix非存在下および存在下で6時間処理し，処理終了後新鮮な培養液でさらに18時間培養した．

6.　細胞増殖抑制試験

染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため，被験物質の細胞増殖に及ぼす影響を調べた．培養終了後，細胞を10 vol%ホルマリン水溶液で固定し，0.1 w/v%クリスタルバイオレット水溶液で染色した．被験物質のCHL/IU細胞に対する増殖抑制作用は，単層培養細胞密度計(Monocellater™，オリンパス光学工業 )を用いて各群の増殖度を計測し，被験物質処理群の媒体対照群に対する細胞増殖の比をもって指標とした．

その結果，S9 mix非存在下および存在下の短時間処理では，5.0 mg/mLにおいても，増殖抑制作用は認められなかった．一方，連続処理における50 %細胞増殖抑制濃度は4.3 mg/mLとなった(Fig. 1)．

7.　実験群の設定

細胞増殖抑制試験の結果より，染色体異常試験で用いる被験物質の高濃度群はすべての処理群において5.0 mg/mLとし，短時間処理では公比2で計4濃度，連続処理では公比2で計5濃度を設定した(S9 mix非存在下および存在下の短時間処理:0.63〜5.0 mg/mL，連続処理:0.31〜5.0 mg/mL)．

また，陽性対照物質として用いたマイトマイシンC(MMC，協和醗酵工業)およびシクロホスファミド(CP，Sigma Chemical)は，日局注射用水(大塚製薬工場)に溶解して調製した．それぞれ染色体異常を誘発することが知られている濃度を適用した．

染色体異常試験において，溶媒対照群と処理群では1濃度あたり4枚のディッシュを用いた．このうちの2枚は染色体標本を作製し，残りの2枚については単層培養細胞密度計により細胞増殖率を測定した．無処理対照群および陽性対照群については細胞増殖率測定は行わなかった．

8.　染色体標本作製法

培養終了の2時間前に，コルセミドを最終濃度が約0.1 μg/mLになるように培養液に加えた．染色体標本の作製は常法に従って行った．スライド標本は各ディッシュにつき6枚作製した．作製した標本は3 vol%ギムザ溶液で染色した．

9.　染色体分析

細胞増殖率と分裂指数を細胞毒性の指標として，20 %以上の相対増殖率で，かつ2ディッシュともに0.5 %以上の分裂指数を示した最も高い濃度を観察対象の最高濃度群とし，観察対象の3濃度群を決定した．その結果(Table 1〜3)，観察可能な最高濃度はすべての処理群において，5.0 mg/mLであったことから，この濃度を高濃度群として3濃度群を観察対象とした．

作製したスライド標本のうち，1つのディッシュから得られた異なるスライドを，4名の観察者がそれぞれ処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した．染色体の分析は，日本環境変異原学会・哺乳動物試験研究会(MMS)1)による分類法に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型のギャップ，切断，交換などの構造異常の有無と倍数性細胞(polyploid)の有無について観察した．また構造異常については1群200個，倍数性細胞については1群800個の分裂中期細胞を分析した．

10.　判定

染色体異常を有する細胞の出現頻度について，溶媒対照群と被験物質処理群および陽性対照群間でフィッシャーの直接確率法2)により，有意差検定を実施した(p<0.01)．また，用量依存性に関してコクラン・アーミテッジの傾向性検定3)(p<0.01)を行った．これらの検定結果を参考とし，生物学的な観点からの判断を加味して染色体異常誘発性の評価を行った．

結果および考察

1,3,5-トリス(3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシベンジル)イソシアヌル酸を加えてS9 mix非存在下および存在下で短時間処理した場合には，いずれの処理群においても染色体の構造異常の有意な増加は認められなかった(Table 1，2)．倍数性細胞についてはS9 mix非存在下で短時間処理した2.5 mg/mL(中濃度群)および5.0 mg/mL(高濃度群)で有意に増加が認められ(1.1 %および3.4 %)，誘発性が求められた(Table 1)．S9 mix存在下で短時間処理した場合は，傾向性検定では有意差が認められたが，いずれの濃度群においても，陰性対照と比較して，有意差は認められなかった(Table 2)．

24時間連続処理においては，いずれの処理群においても染色体の構造異常は認められなかった．倍数性細胞については，濃度に依存した出現率の増加(1.0〜3.1 %)が認められ，陽性の結果が得られた(Table 3)．

以上の結果から，倍数性が陽性と判定されたS9 mix非存在下の短時間処理および24時間連続処理群についてD20値を求めたところ，それぞれ30 mg/mL，および33 mg/mLとなった．

陽性対照物質として用いたMMCは，S9 mix非存在下で短時間処理および24時間連続処理した場合において染色体の構造異常を誘発し(Table 1，2)，CPはS9 mix存在下で短時間処理した場合において染色体の構造異常を誘発した(Table 3)．これらの陽性対照物質の結果より，本実験系の成立が確認された．

なお，被験物質は，細菌を用いる復帰変異試験で陰性の結果が得られている5)．また，関連物質である1,3,5-トリス(2-プロペニル)イソシアヌル酸(trially isocyanurate)については染色体異常で代謝活性化された場合に，構造異常および倍数性細胞とも陽性と報告されているが6)，当該試験と並行して実施した染色体異常試験では陰性の結果が得られている5)．また，butylated bydroxytolueneについては，染色体異常試験で陰性の結果が報告されている6)．

以上の結果より，1,3,5-トリス(3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシベンジル)イソシアヌル酸は，本試験条件下でCHL/IU細胞に染色体異常は誘発しないが，倍数性細胞は弱いながらも誘発すると結論した．

文献

1)日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会(編):「化学物質による染色体異常アトラス」朝倉書店，東京 (1988) pp. 16-37．
2)吉村　功(編):「毒性・薬効データの統計解析，事例研究によるアプローチ」サイエンティスト，東京 (1987) pp. 76-78．
3)吉村　功，大橋靖夫(編):「毒性試験講座14，毒性試験データの統計解析」地人書館，東京 (1992) pp. 218-223．
4)石館　基（監修)「<改定> 染色体異常試験データ集」エル・アイ・シー，東京 (1987) p. 23．
5)原　巧 ら：1,3,5-トリス (3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシベンジル) イソシアヌル酸の細菌を用いる復帰変異試験．化学物質毒性試験報告，11：501-505 (2004)．
6)祖父尼俊雄(監修):「染色体異常試験データ集」改定1998年版，エル・アイ・シー，東京 （1999） pp. 449-500．

連絡先
試験責任者：田中憲穂
試験担当者：山影康次，高橋俊孝，若栗　忍，
中川ゆづき，橋本恵子，三枝克彦，
加藤初美
（財）食品薬品安全センター秦野研究所
〒257-8523　神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Noriho Tanaka(Study director)
Kohji Yamakage,
Toshitaka Takahashi,
Shinobu Wakuri, Yuzuki Nakagawa,
Keiko Hashimoto, Katsuhiko Saegusa,
Hatsumi Kato
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257-8523, Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627