1,3,5-トリス(3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシベンジル)イソシアヌル酸の
ラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験
Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of
1,3,5-Tris(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxybenzyl) isocyanuric acid in Rats
要約
1,3,5-トリス(3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシベンジル)イソシアヌル酸を0(対照群)，100，300及び1000 mg/kgの用量でCrj:CD(SD)IGS系雌雄ラットに28日間強制経口投与し，その毒性を検討した．対照群，300及び1000 mg/kg群については，別に14日間の回復群を設けた．
一般状態，体重，摂餌量，尿検査，血液学検査，血液化学検査及び病理学検査では，被験物質投与の影響は認められなかった．
以上の如く，最大投与量の1000 mg/kg投与群においても明らかな毒性変化は認められなかった．したがって，本試験における1,3,5-トリス(3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシベンジル)イソシアヌル酸の無影響量は雌雄ともに1000 mg/kg/dayであった．
方法
1. 被験物質及び被験液の調製
1,3,5-トリス(3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシベンジル)イソシアヌル酸(旭電化工業，東京，ロット番号10970，純度100 %)は無臭の白色粉末である．なお，投与終了後の残余被験物質を供給元で分析した結果，使用期間中は安定であったことが確認された．
被験物質は，投与容量が10 mL/kg体重となるように乳鉢を用いて，0.5 w/v%ヒドロキシプロピルメチルセルロース溶液に懸濁して10，30及び100 mg/mL溶液を調製した．調製は最大7日分を一括して行い，1日分ずつ褐色ガラス瓶(遮光瓶)に入れて冷蔵(設定4℃，実測値:2〜6℃)で保存した．なお，被験液は上記条件下で安定であることを確認した．また，投与1及び投与4週の2回，投与に使用した被験液について濃度及び均一性を測定した結果，適正な濃度，均一性であった．
2. 使用動物及び飼育条件
Sprague-Dawley系SPFラット〔Crj:CD(SD)IGS，日本チャールス・リバー，厚木飼育センター〕の雌雄各57匹を5週齢で入手し，9日間検疫・馴化飼育した後，体重増加が順調で一般状態に異常のみられない健康な雌雄各42匹を選び，6週齢で試験に供した．投与開始日の体重範囲は，雄で215〜240 g(平均値:226 g)，雌で161〜194 g(平均値:175 g)であり，いずれの動物の体重も平均値± 20 %以内であった．
動物は，群分け当日の体重に基づいて層別化し，各群平均体重がほぼ均等となるよう，コンピュータを用いて各群に割り付けた．
動物は，温度23 ± 3℃，相対湿度50 ± 20 %，換気回数1時間当たり10〜15回，照明1日12時間の飼育室で，金属製網ケージに1匹ずつ収容し，固形飼料(CRF-1，オリエンタル酵母工業)及び飲料水(水道水)を自由に摂取させ飼育した．
3. 投与量，群構成及び動物数
2週間投与による予備試験(投与量:125，250，500及び1000 mg/kg)の結果，1000 mg/kg投与群の雄で副腎の絶対及び相対重量の高値が認められたのみであった．これらの結果から，本試験では100，300及び1000 mg/kgの3用量を設定し，これに対照群を加えた計4群を使用した．さらに，対照群，300及び1000 mg/kg群では回復群を設けた．動物数はいずれの群も雌雄各6匹とした．
被験液の投与容量は10 mL/kg体重とし，胃管を用いて1日1回28日間強制経口投与した．対照群には溶媒(0.5 w/v%ヒドロキシプロピルメチルセルロース溶液)を同様に投与した．投与液量は最新の体重を基準に算出した．回復期間は14日間とした．
4. 検査項目
1) 一般状態の観察
投与期間中は毎日2回以上，回復期間中は毎日1回観察した．
(1) 詳細な一般状態の観察
投与開始前に1回，投与期間中及び回復期間中は毎週1回観察した．なお，観察及び検査は投与の情報を制限し，動物をランダムに配置した状態(ブラインド)で行った．
ホームケージ内観察
姿勢，痙攣，異常行動
手に持っての観察
ホームケージからの取り出し易さ，ハンドリングに対する反応(ハンドリング時の発声を含む)，被毛・皮膚の状態(被毛の汚れ，粗毛，外傷，皮膚の色など)，眼球(眼球突出，眼瞼の開き具合)，眼・鼻の分泌物，可視粘膜，自律神経機能(流涙，流涎，立毛，瞳孔径，呼吸)
オープンフィールド内観察
歩行，姿勢，覚醒状態，振戦，痙攣，立ち上がり回数，排泄物(排糞数，排尿)，常同行動(身繕い，旋回など)，異常行動(自咬，後方突進など)
(2) 機能検査
投与第4週及び回復第2週に以下の検査をブラインドで行った．
[聴覚反応，接近反応，接触反応，痛覚反応，瞳孔反射，空中正向反射，着地開脚幅]
(3) 握力測定
上記機能検査に引き続き，前肢及び後肢の握力測定(CPUゲージMODEL-9502 A，アイコーエンジニアリング)の測定をブラインドで行った．
(4) 自発運動量の測定
上記握力測定に引き続き，投与第4週及び回復第2週に自発運動量の測定(実験動物用自発運動センサーNS-AS01，ニューロサイエンス)の測定をブラインドで行った．測定は1時間行い，10分間隔及び60分間の運動量を集計した．
2) 体重
投与期間及び回復期間を通じ，週2回(投与第1週と回復第1週は3回)の頻度で体重を測定した．
3) 摂餌量測定
投与期間及び回復期間を通じ，週2回(投与第1週は3回)の頻度で摂餌量を測定した．
4) 血液学検査
投与期間及び回復期間終了の翌日の剖検時に検査を行った．前日から一夜(約16時間)絶食させた動物をエーテル麻酔下で開腹し，腹大動脈から抗凝固剤(EDTA-2 K)を加えた採血ビンに血液を採取し，赤血球数(電気抵抗変化検出法)，ヘモグロビン量(シアンメトヘモグロビン法)，ヘマトクリット値(平均赤血球容積及び赤血球数から算出)，平均赤血球容積(電気抵抗変化検出法)，平均赤血球血色素量(ヘモグロビン量及び赤血球数から算出)，平均赤血球血色素濃度(ヘモグロビン量及びヘマトクリット値から算出)，血小板数(電気抵抗変化検出法)，白血球数(電気抵抗変化検出法)(以上コールター全自動8項目血球アナライザーT890，ベックマン・コールター)，網赤血球率(Brecher法)及び白血球百分率(May-Giemsa鏡検法)を測定した．また，3.8 %クエン酸ナトリウムを加えた容器に採取した血液を遠心分離(3000回転/分，10分間)し，得られた血漿を用いてプロトロンビン時間(クロット法)，活性化部分トロンボプラスチン時間(クロット法)及びフィブリノーゲン量(トロンボプラスチン法)(以上，血液凝固自動測定装置，ACL 100，Instrumentation Laboratory)を測定した．
5) 血液生化学検査
血液学検査のための採血と同時に腹大動脈から採血し，遠心分離(3000回転/分，10分間)により得られた血清を用いてAlP(Bessey-Lowry法)，総コレステロール(CEH-COD-POD法)，トリグリセライド(LPL-GK-GPO-POD法)，リン脂質(PLD-ChOD-POD法)，総ビリルビン(ビリルビンオキシダーゼ法)，グルコース(グルコースデヒドロゲナーゼ法)，尿素窒素(Urease-LEDH法)，クレアチニン(Creatininase-creatinase-sarcosine oxidase-POD法)，ナトリウム，カリウム及び塩素(イオン選択電極法)，カルシウム(OCPC法)，無機リン(モリブデン酸法)，総たん白質(Biuret法)，アルブミン(BCG法)及びA/G比(総たん白質及びアルブミンから算出)を測定した．また，ヘパリンを加えた容器に採血し，遠心分離(3000回転/分，10分間)により得られた血漿を用いてASAT，ALAT，LDH(UV-rate法)及びγ-GTP(γ-グルタミル-3-カルボキシ-4-ニトロアニリド法)(以上，臨床化学自動分析装置TBA-120FR，東芝)を測定した．
6) 尿検査
投与第4週(検査当日の投与後)と回復第2週に動物を代謝ケージに個別に収容し，絶食・自由摂水下で4時間尿を，次いで自由摂食・自由摂水下でその後の20時間尿を採取した．採取した最初の4時間尿を用いてpH，たん白質，ケトン体，グルコース，潜血，ビリルビン，ウロビリノーゲン(以上オーションスティックス-7EA試験紙，アークレイ)，色調(肉眼観察)及び沈渣(鏡検)を検査した．また，その後に得られた20時間尿を用いて浸透圧(氷点降下法，自動浸透圧測定装置 オートアンドスタット OM-6030，アークレイ)を測定し，4時間尿量及び20時間尿量から1日の尿量を算出した．更に，代謝ケージに収容した状態で，前日からの1日の摂水量を給水瓶を用いて測定した．
7) 剖検及び器官重量
上記血液学検査及び血液生化学検査のための採血後に放血致死させ，外表異常の有無を観察した後，頭部，胸部及び腹部を含む全身の器官・組織について肉眼的に異常の有無を観察した．続いて，脳，下垂体，甲状腺(上皮小体を含む)，胸腺，心臓，肺(気管支を含む)，肝臓，脾臓，腎臓，副腎，精巣，精巣上体，精嚢，卵巣及び子宮を摘出後，器官重量(絶対重量)を測定した．また，絶食後の体重及び絶対重量から体重100 g当たりの相対重量を算出した．
8) 病理組織学検査
全動物について以下に示す全器官・組織を採取し，リン酸緩衝10 %ホルマリン液(但し，眼球はリン酸緩衝液で調製した3 %グルタルアルデヒド・2.5 %ホルマリン液で，精巣及び精巣上体はブアン液で固定した後リン酸緩衝10 %ホルマリン液で保存)で固定した後パラフィンに包埋した．投与期間終了時剖検動物では，このうち対照群と高用量群は包埋した全ての器官・組織について切片とし，ヘマトキシリン・エオジン(H.E.)染色を施して鏡検した．その結果，被験物質投与による影響が認められなかったため，主群の中間用量群及び回復群は検査しなかった．
[脳，脊髄，坐骨神経，眼球，下垂体，甲状腺(上皮小体を含む)，副腎，胸腺，脾臓，顎下リンパ節，腸間膜リンパ節，心臓，気管，肺(気管支を含む)，胃，十二指腸，空腸，回腸，盲腸，結腸，直腸，肝臓，腎臓，膀胱，精巣，精巣上体，前立腺，精嚢，卵巣，子宮，骨及び骨髄(胸骨・大腿骨)，大腿部骨格筋]
5. 統計解析
各検査項目のうち，数値化した成績についてまずBartlett法により各群の分散の均一性の検定(有意水準:両側1 %)を行った．その結果，分散が均一の場合にはDunnett法を用いて対照群と各投与群との平均値の差の検定を，分散が均一でない場合には，Dunnett型の方法(mean rank test法)を用いて対照群と各投与群との平均順位の差の検定を行った(有意水準:いずれも両側5及び1 %)．また，尿の定性的項目及び病理組織学検査の成績についてはMann-WhitenyのU検定(有意水準:片側5及び1 %)を行った．
結果
1. 一般状態
いずれの動物においても，投与期間及び回復期間を通じ異常はみられなかった．
詳細な一般状態観察，機能検査，握力測定及び自発運動量の測定においては，100 mg/kg投与群の雌で投与第4週の着地開脚幅に有意な低値が認められたが，用量との関連性はなかった．また，300 mg/kg投与群の雄で回復第2週の0から10分の自発運動量に有意な低値，1000 mg/kg投与群の雄で回復第2週の50から60分の自発運動量に有意な低値が認められたが，投与第4週にみられない変化であった．その他の検査項目では，いずれの動物にも異常はみられなかった．
2. 体重(Fig.1)
各被験物質投与群の雌雄ともに，投与期間及び回復期間を通じ対照群と同様な体重推移を示し，有意差は認められなかった．
3. 摂餌量
各被験物質投与群の雌雄ともに，投与期間及び回復期間を通じ対照群と同様な摂餌量を示し，有意差は認められなかった．
4. 血液学検査(Table 1)
1) 投与期間終了時検査
血小板数の有意な高値が1000 mg/kg投与群の雌に認められた．その他の検査項目には各被験物質投与群と対照群との間に有意差は認められなかった．
2) 回復期間終了時検査
網赤血球率の有意な低値が1000 mg/kg投与群の雄に，白血球数の有意な低値及び好酸球比率の有意な高値が1000 mg/kg投与群の雌に，単球比率の有意な低値が300 mg/kg投与群の雄に認められたが，投与期間終了時にはみられない変化であった．
5. 血液生化学検査(Table 2)
1) 投与期間終了時検査
尿素窒素の有意な高値が300 mg/kg投与群の雄に認められたが，用量との関連性はなかった．その他の検査項目には各被験物質投与群と対照群との間に有意差は認められなかった．
2) 回復期間終了時検査
塩素の有意な高値が300 及び1000 mg/kg投与群の雄に，無機リンの有意な低値及びA/G比の有意な高値が1000 mg/kg投与群の雄に認められたが，投与期間終了時にはみられない変化であった．
6. 尿検査(Table 3)
1) 投与第4週検査
各被験物質投与群の雌雄ともに，対照群との間に有意差は認められなかった．
2) 回復第2週検査
尿pHの酸性化が300 mg/kg投与群の雄に認められたが，投与第4週時にみられず，用量との関連性もなかった．また，ケトン体陽性例の有意な増加が1000 mg/kg投与群の雄に認められたが，投与第4週時にみられない変化であった．
7. 器官重量(Table 4)
1) 投与期間終了時剖検例
雄では，1000 mg/kg群で肺の相対重量の有意な増加，副腎の絶対重量の有意な減少がみられた．
雌では，100，300及び1000 mg/kg群で脾臓の相対重量の有意な増加にみられたが，各群の値は同等であり，用量との関連性はなかった．
2) 回復期間終了時剖検例
いずれの器官においても各被験物質投与群と対照群との間に有意差は認められなかった．
8. 剖検所見
1) 投与期間終了時剖検例
甲状腺の小型化(片側性)が対照群の雌1例，甲状腺の無形成(片側性)が対照群の雄1例にみられた．その他の器官・組織に異常はみられなかった．
2) 回復期間終了時剖検例
いずれの器官・組織においても，異常はみられなかった．
9. 病理組織学検査(Table 5)
1) 投与期間終了時剖検例
いずれの所見も出現状況及び病理学的性状から偶発所見と判断した．
2) 回復期間終了時剖検例
主群の検査において，被験物質投与の影響が認められなかったため，検査しなかった．
考察
一般状態，体重，摂餌量，尿検査(摂水量を含む)，血液化学検査及び病理組織学検査では，被験物質投与の影響は認められなかった．
血液学検査では，血小板数の有意な高値が1000 mg/kg投与群の雌に認められたが，その値は回復群の対照群とほぼ同等であることから，1000 mg/kg投与群の雌の値が高いと考えるよりはむしろ，主群の対照群の値が低かったことによる偶発的変化と判断した．
器官重量では，肺の相対重量の高値，副腎の絶対重量の低値が1000 mg/kg投与群の雄に認められたが，その程度は軽度であり，かつ相対又は絶対重量のみであること，更には組織異常を伴っていないことから，偶発的変化と考えられた．また，脾臓の相対重量の高値が100，300及び1000 mg/kg投与群の雌に認められたが，各被験物質投与群の値は同等であり，用量との関連性はないこと，かつ変化の程度は軽度であり，組織異常を伴っていないことから，偶発的変化と考えられた．
以上の如く，最大投与量の1000 mg/kg投与群においても明らかな毒性変化は認められなかった．したがって，本試験における1,3,5-トリス(3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシベンジル)イソシアヌル酸の無影響量は雌雄ともに1000 mg/kg/dayであった．
| 連絡先 |
| 試験責任者： | 石田 茂 |
| 試験担当者： | 下山泰史，畠山和久，
枝元洋，津田敏治
勝亦倶慶 |
| （株）ボゾリサーチセンター御殿場研究所 |
| 〒412-0039 静岡県御殿場市かまど1284 |
| Tel. 0550-82-2000 | Fax. 0550-82-2379 | |
| Correspondence |
| Authors: | Shigeru Ishida(Study director)
Yasushi Shimoyama,
Kazuhisa Hatayama
Hiroshi Edamoto, Toshiharu Tsuda
Toyohisa Katsumata |
| Gotemba Laboratory, Bozo Research Center Inc. |
| 1284, Kamado, Gotemba-shi, Shizuoka, 412-0039, Japan |
| Tel +81-550-82-2000 | Fax +81-550-82-2379 | |