トリレンジイソシアナートの細菌を用いる復帰変異試験

Reverse Mutation Test of Tolylene diisocyanate on Bacteria

要約

トリレンジイソシアナートについて，Salmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAを用いる復帰変異試験を実施した．

予備試験の結果をもとに，本試験ではS9 mix非共存下および共存下のTA100，TA1535は5000〜78.1 μg/plate(公比2)の7用量，WP2 uvrAは5000〜156 μg/plate(公比2)の6用量，TA98，TA1537は5000〜313 μg/plate(公比2)の5用量をそれぞれ設定した．

2回の本試験の結果，本試験においてS9 mix共存下のTA100およびTA98で陰性(溶媒)対照値の2倍以上を示す復帰変異コロニー数の増加が認められた．S9 mix非共存下のTA100，TA98およびその他の菌株では，いずれの試験においても陰性(溶媒)対照値の2倍以上を示す復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．S9 mix共存下のTA100およびTA98は2回の本試験で再現性が得られなかったため，5000〜9.77 μg/plate(公比2)の10用量で確認試験を実施したところ，TA100，TA98のいずれにおいても陰性(溶媒)対照値の2倍以上を示す復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．しかし，本被験物質はS9 mix中のS9濃度を増すことで陽性となるとの報告があるため，TA100およびTA98についてS9濃度を30 %としたS9 mix(30 % S9 mix)を用いて追加試験を実施した．はじめに5000〜78.1 mg/plate(公比2)の7用量で追加試験〜を実施した後，さらに100〜1000 mg/plate(公差)の10用量で追加試験およびを実施した．

その結果，追加試験およびにおいて，TA100で陰性(溶媒)対照値の2倍以上を示す復帰変異コロニー数の増加が認められ，再現性も確認された．なお，10 % S9 mixでは公差による試験を実施していなかったため，同じく100〜1000 mg/plateの10用量で試験を実施したが，TA100，TA98のいずれにおいても陰性(溶媒)対照値の2倍以上を示す復帰変異コロニー数の増加は認められず，10 %のS9 mixでは陽性を示さないことが確認された．

以上の結果から，トリレン ジイソシアナートは細菌を用いる復帰変異試験において，S9 mix中のS9濃度を30 %にした条件下で変異原性を有する(陽性)と判定した．

材料および方法

1.　テスト菌株

カリフォルニア大学B. N. Ames教授より1983年5月27日に入手したSalmonella typhimurium TA98，TA100，TA1535，TA1537 1)および東京大学医科学研究所 松島教授より1985年10月14日に入手したEscherichia coli WP2 uvrA 2)の5菌株を用いた．テスト菌株は菌懸濁液にジメチルスルホキシド(DMSO:関東化学(株))を加え，0.2 mLずつ小分けしてドライアイス・アセトン中で急速凍結した後，超低温槽で-80 ℃以下に凍結保存したものを使用した．これら菌株はアミノ酸要求性，紫外線感受性，膜変異，薬剤耐性などの遺伝的特徴を事前に調べ，特性を備えていることを確認した．

2.　テスト菌株の前培養

L字型試験管に2.5 %ニュートリエントブロス(Oxoid Nutrient Broth No. 2, Unipath社)溶液を10 mL分注し，これに凍結保存した菌懸濁液を解凍して20 μLを接種した．37 ℃で8時間振盪培養した後，濁度計を用いて菌濃度を測定し，生菌数が1 × 109/mL以上であることを確認した．

3.　被験物質

トリレンジイソシアナート(ロット番号:171，日本ポリウレタン工業(株)(福岡)提供)は，純度99.8 %(トルエン2,4-ジイソシアナートおよびトルエン2,6-ジイソシアナートを80:20で含有)の無色または淡黄色液体である．被験物質は使用時まで室温に保存した．

被験物質原体は，水と反応してCO2を発生し，紫外線で黄変する．

4.　被験物質溶液の調製

モレキュラーシーブ(0.4 nm, MERCK社)を用いて脱水したDMSOを用いて最高用量の溶液を調製した後，同溶媒で所定用量に段階希釈し，速やかに試験に使用した．

5.　陽性対照物質

陽性対照物質として下記のものを用いた．陽性対照物質溶液は，あらかじめ所定の濃度に調製し，-80 ℃以下に凍結保存したものを使用した．
AF-2:2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(和光純薬工業(株))
NaN3:アジ化ナトリウム(和光純薬工業(株))
ENNG:N-エチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(Sigma Chemical Co.)
9-AA:9-アミノアクリジン(Sigma Chemical Co.)
2-AA:2-アミノアントラセン(和光純薬工業(株))
NaN3は注射用水((株)大塚製薬工場)に，その他はDMSOに溶解したものを使用した.

6.　培地およびS9 mixの組成

1)　トップアガー

アミノ酸水溶液として，精製水を用いて0.5 mM D-ビオチン，L-ヒスチジン混合水溶液(サルモネラ用)または0.5 mM L-トリプトファン水溶液(大腸菌用)を調製し，これをろ過滅菌後，冷蔵庫に保管した．精製水100 mLに対して，粉末寒天(Bacto-Agar，Difco社)0.6 g，塩化ナトリウム0.5 gの割合で加え，オートクレーブで滅菌し完全に溶解させた後，上記のアミノ酸水溶液を1/10量加えて混和し，約45 ℃に保温した．

2)　最少グルコース寒天平板培地

クリメディアAM-N培地(オリエンタル酵母工業(株))を購入し，使用した．なお，培地1 Lあたりの組成は下記のとおりである．
硫酸マグネシウム・七水塩0.2 g
クエン酸・一水塩2 g
リン酸水素二カリウム10 g
リン酸一アンモニウム1.92 g
水酸化ナトリウム0.66 g
グルコース20 g
寒天(OXOID Agar No. 1)15 g
径90 mmのシャーレ1枚あたり30 mLを流して固めてある．

3)　S9 mix

S9 mix 1 mLあたり以下の組成で調製し，使用時まで氷中に保存した．
S9*0.1あるいは0.3 mL
塩化マグネシウム六水塩8 μmol
塩化カリウム33 μmol
D-グルコース6-リン酸5 μmol
β-NADPH4 μmol
β-NADH4 μmol
ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)100 μmol
滅菌精製水残　量
*:購入したS9(キッコーマン(株))を使用した．このS9は，7週齢の雄のSD系ラットにフェノバルビタールと5,6-ベンゾフラボンを併用投与して作製した肝ホモジネートの9000 × g遠心上清分画である．

7.　試験方法

試験は，プレインキュベーション法で行った．

滅菌した試験管に被験物質溶液を0.1 mL，0.1 Mナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)を0.5 mLおよび菌懸濁液を0.1 mL加え，37 ℃で20分間振盪培養した．S9 mixを共存させる場合には，0.1 Mナトリウム-リン酸緩衝液の代わりにS9 mix(10 %あるいは30 %)を0.5 mL添加した．プレインキュベーション後，トップアガー2 mLを上記の混合液に加え混和し，最少グルコース寒天平板培地上に重層した．重層したトップアガーが凝固した後，37 ℃で48時間培養した．

実体顕微鏡を用いて菌叢の生育状態を観察し，被験物質による抗菌性の有無を調べた後，目視により被験物質の沈殿の有無を確認した．プレート上の復帰変異コロニー数を自動コロニーカウンターまたは目視で計測した．予備試験は各用量につき1枚のプレートを使用した．本試験，確認試験および追加試験は各用量につき3枚のプレートを使用した．試験はそれぞれの条件下で再現性が確認されるまで繰り返し実施した．また，被験物質溶液の代わりに陰性対照物質(溶媒)および各菌株毎の陽性対照物質を用いて，被験物質群と同様の操作を行う対照群を設けた．なお，S9 mix共存下での陽性対照試験は，30 % S9 mixを用いた試験においても10 % S9 mixで実施した．

8.　試験結果の判定基準

いずれかの試験菌株で，S9 mixの有無によらず，被験物質用量の増加にともなって復帰変異コロニー数(平均値)が陰性(溶媒)対照値の2倍以上に増加し，さらにその増加に再現性が認められる場合に，当該被験物質は変異原性を有する(陽性)と判定した．被験物質が陽性と判定された場合は，比変異活性値(被験物質1 mgあたりの誘発復帰変異コロニー数)を算出した．なお，試験結果の判定には統計学的手法は用いなかった．

結果および考察

1.　予備試験

予備試験を5000，1250，313，78.1，19.5，4.88，1.22 μg/plateの7用量で実施した結果，S9 mixの有無によらず，いずれの菌株においても復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．また，S9 mix非共存下および共存下のTA100，T1535，WP2 uvrAでは5000 μg/plateで抗菌性が認められた．従って，本試験ではS9 mix非共存下および共存下のTA100，TA1535は5000，2500，1250，625，313，156，78.1 μg/plateの7用量，WP2 uvrAは5000，2500，1250，625，313，156 μg/plateの6用量，TA98，TA1537は5000，2500，1250，625，313 μg/plateの5用量をそれぞれ設定した．

2.　本試験

試験の結果をTable 1, 2に示した．本試験を2回実施した結果，本試験においてS9 mix共存下のTA100およびTA98で陰性(溶媒)対照値の2倍以上を示す復帰変異コロニー数の増加が認められた．S9 mix非共存下のTA100，TA98およびその他の菌株では，いずれの試験においても陰性(溶媒)対照値の2倍以上を示す復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．また，S9 mix非共存下および共存下のTA100，TA1535，WP2 uvrAで抗菌性が認められた．S9 mix共存下のTA100，TA98では2回の本試験で結果に再現性が得られなかったため，5000，2500，1250，625，313，156，78.1，9.77 μg/plateの10用量で確認試験を実施した．

3.　確認試験

試験の結果をTable 3に示した．確認試験の結果，TA100，TA98のいずれにおいても陰性(溶媒)対照値の2倍以上を示す復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．また，TA100，TA98のいずれにおいても抗菌性が認められた．しかし，本被験物質はS9 mix中のS9濃度を増すことで陽性となるとの報告があるため，TA100およびTA98についてS9濃度を30 %としたS9 mix(30 % S9 mix)を用いて追加試験を実施した．はじめに5000，2500，1250，625，313，156，78.1 mg/plateの7用量で追加試験〜を実施した後，さらに100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000 mg/plateの10用量で追加試験およびを実施した．

4.　追加試験

試験の結果をTable 4〜8に示した．S9濃度を30 %として追加試験を実施した結果，追加試験およびのTA100で陰性(溶媒)対照値の2倍以上を示す復帰変異コロニー数の増加が認められ，再現性も確認された．なお，10 %のS9 mixでは公差による試験を実施していなかったため，同じく100〜1000 μg/plateの10用量で試験を実施したが，TA100，TA98のいずれにおいても陰性(溶媒)対照値の2倍以上を示す復帰変異コロニー数の増加は認められず，10 %のS9 mixでは陽性を示さないことが確認された．

S9 mix非共存下および共存下のいずれにおいても，プレート上に沈殿物が認められた．

本被験物質が示した比変異活性値は，7.30 × 102 revertants/mgであった．

なお，S9 mix非共存下および共存下において陽性対照が各菌株に誘発した復帰変異コロニー数は，各菌株の陰性対照の復帰変異コロニー数と比較して明らかに2倍を超えて増加し，陽性の結果を示した． 以上の結果から，トリレンジイソシアナートは細菌を用いる復帰変異試験において，S9 mix中のS9濃度を30 %にした条件下で変異原性を有する(陽性)と判定した．

なお，同物質であるトリレン ジイソシアナート(別名:TDI-80) 3)は，本試験結果と同様に30 % S9 mix条件下で，また，トルエン2,4-ジイソシアナート4)およびトルエン2,6-ジイソシアナート4)は通常の10 % S9 mix条件下で，それぞれ細菌を用いる復帰変異試験で陽性の結果が報告されている．

文献

1)D. M. Maron and B. N. Ames, Mutation Research, 113, 173(1983).
2)M. H. L. Green and W. J. Muriel, Mutation Research, 38, 3(1976).
3)A. Margrethe, B. Mona-Lisa, K. Pauli, L. Henry and M. Jette, Scand j work environ health, 6, 221-226(1980).
4)労働省安全衛生部化学物質調査課監修，“労働安全衛生法 有害性調査制度に基づく既存化学物質変異原性試験データ集，”日本化学物質安全・情報センター，東京，1996, p.213, p.215.

連絡先
試験責任者：榎本佳明
試験担当者：榎本佳明，清水優子，大久保智子
(株)三菱化学安全科学研究所　鹿島研究所
〒314-0255　茨城県鹿島郡波崎町砂山14
Tel 0479-46-2871Fax 0479-46-2874

Correspondence
Authors:Yoshiaki Enomoto(Study director)
Yoshiaki Enomoto, Yuko Shimizu, Tomoko Okubo
Mitsubishi Chemical Safety Institute Ltd., Kashima Laboratory
14 Sunayama, Hasaki-machi, Kashima-gun, Ibaraki, 314-0255 Japan
Tel +81-479-46-2871Fax +81-479-46-2874