)に溶解して最高濃度の調製液を調製した後，同溶媒で所定の濃度に希釈して速やかに試験に用いた．検定菌として，Salmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA1537１）および Escherichia coli WP2 uvrA２）の5菌株を用い，S9 mix無添加および添加の試験のいずれも用量設定試験で抗菌性が認められたことから，本試験はS9 mix無添加試験ではTA1537は0.195〜6.25 μg/プレート，TA1535は0.781〜12.5 μg/プレート，TA100およびTA98は0.781〜25.0 μg/プレート，WP2 uvrA は156〜5000 μg/プレート，S9 mix添加試験では TA100，TA1535，TA98およびTA1537は19.5〜200 μg/プレート，WP2 uvrAは19.5〜625 μg/プレートの範囲で実施した．
その結果，2回の本試験とも用いた5種類の検定菌のいずれの用量においても，溶媒対照値の2倍以上となる復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．
以上の結果から，ジイソプロピルベンゼンは，用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した．
S. typhimurium の4菌株は1975年10月31日にアメリカ合衆国，カリフォルニア大学のB.N. Ames博士から分与を受けた．
E. coli WP2 uvrA株は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた．
検定菌は-80℃以下で凍結保存したものを用い，各菌株の特性確認は，凍結保存菌の調製時に，アミノ酸要求性，UV感受性および膜変異(rfa)とアンピシリン耐性因子pKM 101(プラスミド)の有無について調べ，特性が維持されていることを確認した．
試験に際して，ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し，37℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした．
パナファーム・ラボラトリーズから供与された．被験物質は，使用時まで室温遮光して保管した．本ロットについては，試験期間中安定であることを確認した．
ジイソプロピルベンゼンは，ジメチルスルホキシド(DMSO，ロット番号:DLR7825およびDLF7632，和光純薬工業)に溶解して最高濃度の調製液を調製した後，同溶媒で所定の濃度に希釈して速やかに試験に用いた．
| AF2 | : | 2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(上野製薬) |
| SA | : | アジ化ナトリウム(和光純薬工業) |
| 9AA | : | 9-アミノアクリジン(Sigma Chem. Co.) |
| 2AA | : | 2-アミノアントラセン(和光純薬工業) |
AF2および2AAはDMSOに溶解したものを-20℃で凍結保存し，用時解凍した．9AAはDMSOに，SAは超純水に溶解し，速やかに試験に用いた．
| (A) | バクトアガー(Difco) | 0.6％ |
| 塩化ナトリウム | 0.5％ | |
| (B)* | L-ヒスチジン | 0.5 mM |
| D-ビオチン | 0.5 mM |
*:WP2 uvrA 用には，0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた．
製の最少グルコース寒天培地を用いた．なお，培地1 Lあたりの組成は下記のとおりである．
| 硫酸マグネシウム・7水和物 | 0.2 g |
| クエン酸・1水和物 | 2 g |
| リン酸水素二カリウム | 10 g |
| リン酸一アンモニウム | 1.92 g |
| 水酸化ナトリウム | 0.66 g |
| グルコース | 20 g |
| バクトアガー(清水食品) | 15 g |
径90 mmのシャーレ1枚あたり30 mLを流して固めたものである．
| S9** | 0.1 mL |
| 塩化マグネシウム | 8 μmol |
| 塩化カリウム | 33 μmol |
| グルコース-6-リン酸 | 5 μmol |
| NADH | 4 μmol |
| NADPH | 4 μmol |
| ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4) | 100 μmol |
**:7週齢の Sprague-Dawley 系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および 5,6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製された S9(キッコーマン)を用いた．
小試験管中に，被験物質調製液0.1 mL，リン酸緩衝液0.5 mL(S9 mix添加試験においてはS9 mix 0.5 mL)，検定菌液0.1 mLを混合し，37℃で20分間プレインキュベーションしたのち，トップアガー2 mLを加えて混和し，合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりに使用溶媒，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．各検定菌ごとに用いた陽性対照物質の名称および用量は各Table中に示した．溶媒および陽性対照群は，同時に実施した他の試験と共通とした．培養は37℃で48時間行い，生じた変異コロニー数を算定した．抗菌性の有無については，肉眼あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌膜の状態から判断した．用いた平板は用量設定試験においては，溶媒および陽性対照群では3枚ずつ，各用量については1枚ずつとした．また，本試験においては，両対照群および各用量につき，3枚ずつを用い，それぞれの平均値と標準偏差を求めた．
したがって，本試験における最高用量は，S9 mix無添加試験については，WP2 uvrA では5000 μg/プレート，その他の検定菌では50.0 μg/プレートとした．また，S9 mix添加試験では，WP2 uvrAでは 625 μg/プレート，その他の検定菌では200 μg/プレートとした．
において抗菌性の認められない用量が4用量に満たなかったため，最高用量を6.25 μg/プレートに下げて本試験をやり直した．また，本試験の結果から，TA100，TA1535およびTA98のS9 mix無添加試験では，最高用量を25.0 μg/プレートとして6用量を設定することで，抗菌性の認められない用量を4用量確保できることが判明したため，0.781〜25.0 μg/プレートの範囲で本試験
を実施した．なお，TA1535のS9 mix無添加試験では抗菌性の認められない用量が4用量に満たなかったため，最高用量を25.0 μg/プレートから12.5 μg/プレートにさらに下げて本試験をやり直した．その結果，すべての検定菌において，2回の本試験とも溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加は認められなかった．以上の結果に基づき，ジイソプロピルベンゼンは，用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した．
| 1) | D.M. Maron, B.N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983). |
| 2) | S. Venitt, C. Crofton-Sleigh, "Evaluation of Short-Term Tests for Carcinogens," eds. by F.J. de Serres, J. Ashby, Elsevier/North-Holland, New York, 1981, pp. 351-360. |
| 3) | T. Matsushima, T. Sugimura, M. Nagao, T. Yahagi, A. Shirai, M. Sawamura, "Short-Term Test Systems for Detecting Carcinogens," eds. by K.H. Norpoth, R.C. Garner, Springer, Berlin-Heidelberg-New York, 1980, pp. 273-285. |
| 連絡先 | |||
| 試験責任者： | 澁谷 徹 | ||
| 試験担当者： | 原 巧，川上久美子，堀谷尚古 | ||
| (財)食品薬品安全センター 秦野研究所 | |||
| 〒257-8523 秦野市落合 729-5 | |||
| Tel 0463-82-4751 | Fax 0463-82-9627 | ||
| Correspondence | ||||
| Authors: | Tohru Shibuya(Study Director) Takumi Hara, Kumiko Kawakami, Naoko Horiya | |||
| Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center | ||||
| 729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257-8523, Japan | ||||
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