2,3,6-トリメチルフェノールの細菌を用いる復帰変異試験

Reverse Mutation Test of 2,3,6-Trimethylphenol on Bacteria

要約

2,3,6-トリメチルフェノールについてSalmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAを用いる復帰変異試験をプレインキュベーション法により実施した．

予備試験における抗菌性の結果をもとに，本試験ではS9 mix非共存下および共存下の各菌株について1250〜39.1 μg/plate(公比2)の6濃度を設定した．

本試験を2回実施した結果，被験物質の各濃度において誘発された復帰変異コロニー数は，S9 mixの有無によらず，いずれの菌株においても陰性(溶媒)対照値の2倍以上を示さなかった．また，S9 mix非共存下および共存下のTA100，TA1535は625 μg/plate以上，WP2 uvrA，TA98，TA1537は1250 μg/plateで抗菌性が認められた．従って2,3,6-トリメチルフェノールは本試験系において変異原性を有さない(陰性)と結論した．

方法

［使用菌株］

カリフォルニア大学B. N. Ames教授より1983年5月27日に入手したSalmonella typhimurium TA98，TA100，TA1535，TA1537 1)および東京大学医科学研究所 松島教授より1985年10月14日に入手したEscherichia coli WP2 uvrA 2)の5菌株を用いた．各菌株は超低温槽で-80℃以下に凍結保存したものを使用した．

試験に際して，各凍結菌株を融解後，その20 μLをニュートリエントブロス(Oxoid Nutrient Broth No.2, Unipath社)25 gを1 Lの精製水に溶解して作製した液体完全培地10 mLに接種し，37℃で8時間振盪培養した．培養終了後の菌懸濁液は，濁度計を用いて菌濃度を測定し，各菌株共に生菌数が1×10^9/mL以上であることを確認した．

［被験物質］

2,3,6-トリメチルフェノール(ロット番号:971209，本州化学工業(株)，和歌山)は，純度99.67 %(不純物として，2,4,6-トリメチルフェノール0.08 %，2,5-キシレノール0.05 %を含有)の淡黄色固体である．被験物質は使用時まで室温，暗所に保存した．なお，本ロットの安定性は，実験開始前および実験終了後に被験物質供給者が分析し，確認した．

2,3,6-トリメチルフェノールはジメチルスルホキシド(DMSO，関東化学(株))を用いて最高濃度(50 mg/mL)の溶液を調製した後，同溶媒で所定濃度に段階希釈したものを用いた．

［陽性対照物質］

陽性対照物質として下記のものを用いた．
AF-2:2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(和光純薬工業(株))
NaN3:アジ化ナトリウム(和光純薬工業(株))
ENNG:N-エチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(Sigma Chemical Co.)
9-AA:9-アミノアクリジン(Sigma Chemical Co.)
2-AA:2-アミノアントラセン(和光純薬工業(株))

NaN3は注射用水((株)大塚製薬工場)に，その他はDMSOに溶解したものを使用した.

［培地およびS9 mixの組成］

1)　トップアガー

アミノ酸水溶液として，精製水を用いて0.5 mM D-ビオチン，L-ヒスチジン混合水溶液(サルモネラ用)または0.5 mM L-トリプトファン水溶液(大腸菌用)を調製し，これをろ過滅菌後, 冷蔵庫に保管した．精製水100 mLに対して，粉末寒天(Bacto-Agar，Difco社)0.6 g，塩化ナトリウム0.5 gの割合で加え，オートクレーブで滅菌し完全に溶解させた後，上記のアミノ酸水溶液を1/10量加えて混和し，約45℃に保温した．

2)　最少グルコース寒天平板培地

クリメディアAM-N培地(オリエンタル酵母工業(株))を購入し，使用した．なお，培地1 Lあたりの組成は下記のとおりである．
硫酸マグネシウム・七水塩0.2 g
クエン酸・一水塩2 g
リン酸水素二カリウム10 g
リン酸一アンモニウム1.92 g
水酸化ナトリウム0.66 g
グルコース20 g
寒天(OXOID Agar No.1)15 g

径90 mmのシャーレ1枚あたり30 mLを流して固めてある．

3)　S9 mix

S9 mix 1 mLあたり以下の組成で調製し，使用時まで氷中に保存した．
S9*0.1 mL
塩化マグネシウム六水塩8 μmol
塩化カリウム33 μmol
D-グルコース6-リン酸5 μmol
β-NADPH4 μmol
β-NADH4 μmol
ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)100 μmol
*:購入したS9(キッコーマン(株))を使用した．このS9は，7週齢の雄のSD系ラットにフェノバルビタールと5,6-ベンゾフラボンを併用投与して作製した肝ホモジネートの9000×g遠心上清分画である．

［試験方法］

試験はプレインキュベーション法で実施した．

滅菌した試験管に被験物質溶液を0.1 mL，0.1 Mナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)0.5 mLおよび菌懸濁液を0.1 mL加え，37℃で20分間振盪培養した．S9 mixを共存させる場合には，0.1 Mナトリウム-リン酸緩衝液の代わりにS9 mixを0.5 mL添加した．プレインキュベーション後，トップアガー2 mLを上記の混合液に加え混和し，最少グルコース寒天平板培地上に重層した．重層したトップアガーが凝固した後，37℃で48時間培養した．

実体顕微鏡を用いて菌叢の生育状態を観察し，被験物質による抗菌性の有無を調べた後，目視により被験物質の沈殿の有無を確認した．プレート上の復帰変異コロニー数を自動コロニーカウンターで計測した．予備試験は各用量につき1枚のプレートを使用した．本試験は各用量につき3枚のプレートを使用し，再現性を確認するため2回実施した．また，被験物質溶液の代わりに陰性対照物質(溶媒)および各菌株毎の陽性対照物質を用いて，被験物質群と同様の操作を行う対照群を設けた．

［試験結果の判定基準］

被験物質処理プレートにおける復帰変異コロニー数(平均値)が陰性対照値の2倍以上を示し，明確な用量相関性および再現性が認められる場合に陽性と判定した．

結果および考察

［予備試験］

5000，1250，313，78.1，19.5，4.88，1.22 μg/plateの濃度で実施した結果，S9 mix非共存下および共存下の1250 μg/plate以上で抗菌性が認められた．従って，本試験では1250，625，313，156，78.1，39.1 μg/plateの6濃度を設定した．

［本試験］

結果をTable 1, 2に示した．上記の濃度範囲で試験を実施した結果，2回の本試験ともに，被験物質の各濃度において誘発された復帰変異コロニー数は，S9 mixの有無によらず，いずれの菌株においても陰性(溶媒)対照値の2倍以上を示さなかった．また，S9 mix非共存下および共存下のTA100，TA1535は625 μg/plate以上，WP2 uvrA，TA98，TA1537は1250 μg/plateで抗菌性が認められた．

以上の結果から，2,3,6-トリメチルフェノールは本試験系において変異原性を有さない(陰性)と結論した．

なお，類似化合物である2,6-ジブチル-ρ-クレゾールおよび2,4,6-トリ-tert-ブチルフェノールは，いずれも細菌を用いる復帰変異試験で陰性の結果が報告されている3)．

参考文献

1)D. M. Maron and B. N. Ames, Mutation Research, 113, 173(1983).
2)M. H. L. Green and W. J. Muriel, Mutation Research, 38, 3(1976).
3)石館基監修，"微生物を用いる変異原性試験データ集，"エル・アイ・シー社，東京，1991.

連絡先
試験責任者：宮川　誠
試験担当者：榎本佳明，清水優子，大久保智子
(株)三菱化学安全科学研究所　鹿島研究所
〒314-0255　茨城県鹿島郡波崎町砂山14
Tel 0479-46-2871Fax 0479-46-2874

Correspondence
Authors:Makoto Miyagawa(Study director)
Yoshiaki Enomoto, Yuko Shimizu, Tomoko Okubo
Mitsubishi Chemical Safety Institute Ltd., Kashima Laboratory
14 Sunayama, Hasaki-machi, Kashima-gun, Ibaraki, 314-0255, Japan
Tel +81-479-46-2871Fax +81-479-46-2874