2,2,6,6-テトラメチル-4-ヒドロキシピペリジンの細菌を用いる
復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of 2,2,6,6-Tetramethyl-4-hydroxypiperidine on Bacteria

要約

OECD既存化学物質安全点検に係わる毒性調査事業の一環として，2,2,6,6-テトラメチル-4-ヒドロキシピペリジンについてSalmonella typhimurium TA100, TA1535, TA98，TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAを用いる復帰突然変異試験をプレインキュベーション法により実施した．

予備試験における抗菌性の結果をもとに，本試験ではS9 mix非共存下および共存下の各菌株について5000〜156 μg/プレート(公比2)の6濃度を設定した．

本試験を2回実施した結果，被験物質の各濃度において誘発された復帰変異コロニー数は，S9 mixの有無によらず，いずれの菌株においても陰性(溶媒)対照値の2倍以上を示さなかった．また，S9 mix非共存下のTA1535, WP2 uvrAでは5000 μg/プレート，TA100, TA98, TA1537では2500 μg/プレート以上で，共存下のTA100, TA1537では2500 μg/プレート以上，TA100, TA98, TA1537では5000 μg/プレートでそれぞれ抗菌性が認められた．従って2,2,6,6-テトラメチル-4-ヒドロキシピペリジンの変異原性は陰性と結論した．

方法

〔使用菌株〕

カリフォルニア大学B.N. Ames教授より1983年5月27日に入手したSalmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537１）および東京大学医科学研究所 松島教授より1985年10月14日に入手したEscherichia coli WP2 uvrA２）の5菌株を用いた．各菌株は超低温槽で-80℃以下に凍結保存したものを使用した．

試験に際して，各凍結菌株を融解後，その20 μLをニュートリエントブロス(Oxoid Nutrient Broth No.2, Unipath社)25 gを1 Lの精製水に溶解して作製した液体完全培地10 mLに接種し，37℃で8時間振盪培養した．培養終了後の菌懸濁液は菌濃度を測定した後，試験に使用した．

〔被験物質〕

2,2,6,6-テトラメチル-4-ヒドロキシピペリジン(ロット番号:6509051，三井石油化学工業提供)は，分子式C9H19NO，分子量157.26，純度99.8 %(不純物として，トリアセトンアミン0.1 %以下，2,2,6,6-テトラメチル-4-アミノピペリジン0.02 %，2,2,6,6-テトラメチルテトラヒドロピラン-4-オール0.04 %を含む)の白色顆粒であり，通常の取り扱い条件では安定である．なお，本ロットの安定性は，実験開始前および実験終了後に被験物質供給者が分析し，確認した．

2,2,6,6-テトラメチル-4-ヒドロキシピペリジンは注射用水(DW, 大塚製薬工場)を用いて最高濃度(50 mg/mL)の溶液を調製した後，同溶媒で所定濃度に段階希釈したものを用いた．

〔陽性対照物質〕

陽性対照物質として下記のものを用いた．

AF-2:2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(和光純薬工業)
NaN3:アジ化ナトリウム(和光純薬工業)
ENNG:N-エチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(Sigma Chemical Co.)
9-AA:9-アミノアクリジン(Sigma Chemical Co.)
2-AA:2-アミノアントラセン(和光純薬工業)

NaN3はDWに，その他はジメチルスルホキシド(関東化学)に溶解したものを使用した．

〔培地およびS9 mixの組成〕

1)　トップアガー

アミノ酸水溶液として，精製水を用いてD-ビオチン，L-ヒスチジンおよびL-トリプトファンの0.5 mM混合水溶液を調製し，これをろ過滅菌後, 冷蔵庫に保管した．精製水100 mLに対して，粉末寒天(Bacto-Agar，Difco社)0.6 g, 塩化ナトリウム0.5 gの割合で加え，オートクレーブで滅菌し完全に溶解させた後，上記のアミノ酸水溶液を1/10量加えて混和し，約45℃に保温した．

2)　最少グルコース寒天平板培地

クリメディアAM-N培地(オリエンタル酵母工業)を購入し，使用した．なお，培地1 Lあたりの組成は下記のとおりである．

硫酸マグネシウム七水塩0.2 g
クエン酸一水塩2 g
リン酸水素二カリウム無水塩10 g
リン酸一アンモニウム1.92 g
水酸化ナトリウム0.66 g
ブドウ糖20 g
寒天(OXOID Agar No.1)15 g

径90 mmのシャーレ1枚あたり30 mLを流して固めてある．

3)　S9 mix

S9 mix 1 mLあたり以下の組成で調製し，使用時まで氷中に保存した．

S9*0.1 mL
塩化マグネシウム六水塩8 μmol
塩化カリウム33 μmol
D-グルコース6-リン酸5 μmol
β -NADPH4 μmol
β -NADH4 μmol
ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4) 100 μmol
滅菌精製水残量

*:購入したS9(キッコーマン)を使用した．このS9は，7週齢の雄のSD系ラットにフェノバルビタールと5,6-ベンゾフラボンを併用投与して作製した肝ホモジネートの9000×g遠心上清分画である．

〔試験方法〕

試験はプレインキュベーション法で実施した．

試験管に被験物質溶液0.1 mLを分注し，S9 mix 0.5 mLと菌懸濁液0.1 mLを加え，37℃で20分間振盪し，プレインキュベーションを行った．S9 mixを共存させない場合には，S9 mixの代わりに0.1 Mナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)0.5 mLを加えた．プレインキュベーション後，トップアガー2 mLを上記の試験管に加えて混和し，最少グルコース寒天平板培地に重層した．重層したトップアガーが凝固した後，37℃で48時間培養し，復帰変異コロニー数を計測した．同時に実体顕微鏡を用いて菌叢の生育状態を観察し，被験物質による抗菌性の有無を調べた．予備試験では各濃度につき1枚のプレートを使用し，本試験では各濃度につき3枚のプレートを使用した．本試験は2回実施し，結果の再現性を確認した．また，被験物質溶液の代わりに陰性対照物質(溶媒)および各菌株毎の陽性対照物質を用いて，被験物質群と同様の操作を行う対照群を設けた．

〔試験結果の判定基準〕

被験物質処理プレートにおける復帰変異コロニー数(平均値)が陰性対照値の2倍以上を示し，明確な用量相関性および再現性が認められる場合に陽性と判定した．

結果および考察

〔予備試験〕

5000, 1250, 313, 78.1, 19.5, 4.88, 1.22 μg/プレートの濃度で実施した結果，S9 mix非共存下および共存下のすべての菌株の5000 μg/プレートで抗菌性が認められた．従って，本試験ではS9 mix非共存下および共存下の各菌株について5000, 2500, 1250, 625, 313，156 μg/プレートの6濃度を設定した．

〔本試験〕

結果をTable 1, 2に示した．上記の濃度範囲で試験を実施した結果，2回の本試験ともに，被験物質の各濃度において誘発された復帰変異コロニー数は，S9 mixの有無によらず，いずれの菌株においても陰性(溶媒)対照値の2倍以上を示さなかった．また，S9 mix非共存下のTA1535, WP2uvrAでは5000 μg/プレート，TA100, TA98, TA1537では2500 μg/プレート以上で，共存下のTA100，TA1537では2500 μg/プレート以上，TA100, TA98, TA1537では5000 μg/プレートでそれぞれ抗菌性が認められた．

以上の結果から, 2,2,6,6-テトラメチル-4-ヒドロキシピペリジンの変異原性は陰性と結論した．

文献

1)D.M. Maron and B.N. Ames, Mutation Research, 113, 173(1983).
2)M.H.L. Green and W.J. Muriel, Mutation Research, 38, 3(1976).

連絡先
試験責任者：宮川　誠
試験担当者：榎本佳明，清水優子
三菱化学安全科学研究所　鹿島研究所
〒314-0255　茨城県鹿島郡波崎町砂山14
Tel 0479-46-2871Fax 0479-46-2874

Correspondence
Authors:Makoto Miyagawa(Study director)
Yoshiaki Enomoto, Yuko Shimizu
Mitsubishi Chemical Safety Institute Ltd., Kashima Laboratory
14 Sunayama, Hasaki-machi, Kashima-gun, Ibaraki, 314-0255, Japan
Tel +81-479-46-2871Fax +81-479-46-2874