リン酸トリス（2-エチルヘキシル）の細菌を用いる復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of Tris (2-ethylhexyl) phosphate on Bacteria

要約

OECD既存化学物質安全性点検に係る毒性調査事業の一環として，難分解性既存化学物質の１つであるリン酸トリス（2-エチルヘキシル）について，細菌を用いる復帰突然変異試験をプレート法により実施した．

検定菌として，Salmonella typhimurium TA100, TA1535, TA98, TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAを用い，直接法および代謝活性化法のいずれも，用量設定試験は，50〜5000 μg/プレートの用量で，本試験は312.5〜5000 μg/プレートの用量で試験を実施した．

その結果，２回の本試験とも，用いた５種類の検定菌について，いずれの用量でも復帰変異コロニー数の増加が認められなかったことから，リン酸トリス（2-エチルヘキシル）は，用いた試験系において変異原性を有しない（陰性）と判定された．

方法

〔検定菌〕

Salmonella typhimurium TA100
Salmonella typhimurium TA1535
Escherichia coli WP2 uvrA
Salmonella typhimurium TA98
Salmonella typhimurium TA1537

S. typhimuriumの４菌株は1975年10月31日にアメリカ合衆国，カリフォルニア大学のB. N. Ames博士から分与を受けた．

E. coli WP2 uvrA株は1979年５月９日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた．

検定菌は，-80℃以下で凍結保存した．

試験に際して，ニュートリエントブロスNo.２（Oxoid）を入れたＬ字型試験管に種菌を接種し，37℃，11〜12時間往復振とう培養したものを検定菌液とした．

〔被験物質〕

リン酸トリス（2-エチルヘキシル）（CAS No. 78-42-2）は，分子量434.59，比重0.926（20℃/20℃）の無色ないし淡黄色の透明の液体である．純度99.7％のもの（ロット番号：K40602，大八化学工業（株）製造）を（社）日本化学工業協会から供与された．被験物質は，使用時まで冷所に保管した．

リン酸トリス（2-エチルヘキシル）は，アセトン（ロット番号：DSM4173およびDSR3251，和光純薬工業（株））を用いて50 mg/mlとなるように調製した後，同溶媒で更に公比２ないし３で希釈したものを，速やかに試験に用いた．

秦野研究所においてトリス（2-エチルヘキシル）フォスフェートのアセトン溶液中での安定性試験を染色体異常試験（H-92-292）における最高濃度（880 mg/ml）および最低濃度（0.550 mg/ml）の２濃度について，室温遮光条件下で実施した．その結果，調製後４時間における各３サンプルの平均含量は，それぞれ初期値（０時間）の平均に対して，103および101％であった．

また，本試験に用いた調製検体について，含量測定試験を行った結果，50 mg/ml溶液の含量は既定濃度に対し，93.7〜98.2％，3.125 mg/ml溶液は，89.7〜95.0％であった．

以上の結果から，リン酸トリス（2-エチルヘキシル）はアセトン溶液中では安定であり，また調製液中の被験物質の含量は所定の値の範囲内にあることが確認された．

〔陽性対照物質〕

用いた陽性対照物質およびその溶媒は以下のとおりである．
AF-2：フリルフラマイド（上野製薬（株））
SA：アジ化ナトリウム（和光純薬工業（株））
9-AA：9-アミノアクリジン（Sigma Chem.Co.）
2-AA：2-アミノアントラセン（和光純薬工業（株））
AF-2,2-AAはDMSO（和光純薬工業（株））に溶解したものを-20℃で凍結保存し，用時解凍した．9-AAはDMSOに，SAは蒸留水に溶解し速やかに試験に用いた．

〔培地およびS9混液の組成〕

１） トップアガー（TA菌株用）

下記の水溶液（A）および（B）を容量比10:1の割合で混合した．
（A）バクトアガー（Difco）0.6％
塩化ナトリウム0.5％
（B）*L-ヒスチジン0.5 mＭ
ビオチン0.5 mＭ
*：WP2用には，0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた．

２） 合成培地

培地は，日清製粉（株）製の最少寒天培地を用いた．なお，培地１lあたりの組成は下記のとおりである．
硫酸マグネシウム・7水和物0.2 g
リン酸水素アンモニウムナトリウム・4水和物3.5 g
クエン酸・1水和物２g
グルコース20 g
リン酸水素二カリウム10 g
バクトアガー（Difco）15 g
径90 mmのシャーレ１枚あたり30 mlを流して固めてある．

３） S9混液（１ml中下記の成分を含む）

S9**0.1 ml
NADH4 mmol
塩化マグネシウム8 mmol
NADPH4 mmol
塩化カリウム33 mmol
0.2Mリン酸緩衝液（pH 7.4）0.5 ml
グルコース・6リン酸5 mmol
**：７週齢のSprague-Dawley系雄ラットをフェノバルビタール（PB）および5,6-ベンゾフラボン（BF）の併用投与で酵素誘導して作製したS9（キッコーマン（株））を用いた．

〔試験方法〕

プレート法を用いて，直接法および代謝活性化法によって試験を行った．

小試験管中にトップアガー２ml，被験物質調製液0.1 ml，リン酸緩衝液0.5 ml（代謝活性化試験においてはS9混液0.5 ml），検定菌液0.1 mlを混合したのち合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりにアセトン，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量はTableに示した．培養は37℃で48時間行い，生じた変異コロニー数を算定し，それぞれその平均値と標準偏差を求めた．抗菌性の有無については，肉眼的あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌膜の状態から判断した．

〔判定基準〕

用いた５種の検定菌のうち，１種以上の検定菌の直接法あるいは代謝活性化法において，被験物質を含有する平板上における変異コロニー数の平均値が，陰性対照のそれに比べて２倍以上に増加し，かつ，その増加に再現性あるいは用量依存性が認められた場合に，当該被験物質は本試験系において変異原性を有する（陽性）と判定することとした．

結果および考察

〔用量設定試験〕

リン酸トリス（2-エチルヘキシル）について，50〜5000 μg/プレートの範囲で試験を実施したところ，すべての検定菌の直接法および代謝活性化法において，抗菌性は認められなかった．

以上の結果から，本試験における最高用量を直接法，代謝活性化法ともに，すべての検定菌で5000 μg/プレートとし，５用量を設定することとした．

〔本試験〕

結果をTables 1, 2に示す．リン酸トリス（2-エチルヘキシル）について上記の用量範囲で試験を実施した．２回の試験を通して，用いた５種類の検定菌の直接法，代謝活性化法のいずれにおいても，用量依存性のある変異コロニー数の増加は認められなかった．なお，被験物質に由来する寒天表面の沈殿物は直接法，代謝活性化法ともに，すべての用量で認められた．

以上の結果に基づき，リン酸トリス（2-エチルヘキシル）は，用いた試験系において変異原性を有しないもの（陰性）と判定した．

文献

1）D. M. Maron, and B. N. Ames, Mutation Research. 113, 173-215（1983）.
2）M. H. L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures," （B. J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, and C. Ramel eds.） Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford. 1984, pp.161-187.

連絡先
試験責任者：澁谷　徹
試験担当者：石原尚古，坂本京子，原　巧，加藤基恵，川上久美子，松木容彦，中込まどか
（財）食品薬品安全センター秦野研究所
〒257 神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Tohru Shibuya （Study director）
Naoko Ishihara,
Kyoko Sakamoto,
Takumi Hara,
Motoe Katoh,
Kumiko Kawakami,
Yasuhiko Matsuki,
Madoka Nakagomi
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257, Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627