5-エチリデン-2-ノルボルネンの細菌を用いる復帰変異試験

Reverse Mutation Test of 5-Ethylidene-2-norbornene on Bacteria

要約

5-エチリデン-2-ノルボルネンについて，細菌を用いる復帰変異試験を実施した．

検定菌として，Salmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA1537１）およびEscherichia coli WP2 uvrA２）の5菌株を用い，S9 mix無添加および添加試験のいずれも用量設定試験で抗菌性が認められたことから，本試験はS9 mix無添加試験では，TA1535および TA1537は3.91～125 μg/プレート，TA100，TA98および WP2 uvrA は 7.81～250 μg/プレート，S9 mix添加試験では TA100，TA1535およびTA98は7.81～250 μg/プレート，TA1537およびWP2 uvrAは15.6～500 μg/プレートの範囲で実施した．

その結果，2回の本試験とも用いた5種類の検定菌のいずれの用量においても，溶媒対照値の2倍以上となる復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．

以上の結果から，5-エチリデン-2-ノルボルネンは，用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した．

方法

〔検定菌〕

Salmonella typhimurium TA100
Salmonella typhimurium TA1535
Escherichia coli WP2 uvrA
Salmonella typhimurium TA98
Salmonella typhimurium TA1537

S. typhimurium の4菌株は1975年10月31日にアメリカ合衆国，カリフォルニア大学のB.N. Ames博士から分与を受けた．

E. coli WP2 uvrA株は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた．

検定菌は-80℃以下で凍結保存したものを用い，各菌株の特性確認は，凍結保存菌の調製時に，アミノ酸要求性，UV感受性および膜変異(rfa)とアンピシリン耐性因子pKM 101(プラスミド)の有無について調べ，特性が維持されていることを確認した．

試験に際して，ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し，37℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした．

〔被験物質〕

5-エチリデン-2-ノルボルネンは，分子量120.20の無色透明液体である．用いた被験物質は，ロット番号6J01，純度99.4 wt%〔不純物として軽質分:0.5％(このうちビニルシクロヘプテンを0.3 wt%含み，未知成分は0.2 wt%)，重質分:0.1 wt%〕であり，日本石油化学

から供与された．被験物質は，使用時まで酸化劣化を防止するため窒素シールを行い，室温で保管した．

5-エチリデン-2-ノルボルネンは，ジメチルスルホキシド(DMSO，ロット番号:DLR7825およびDLF7632，和光純薬工業)に溶解して最高濃度の調製液を調製した後，同溶媒で所定の濃度に希釈して速やかに試験に用いた．

〔陽性対照物質〕

用いた陽性対照物質およびその溶媒は以下のとおりである．

AF2	:	2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(上野製薬)
SA	:	アジ化ナトリウム(和光純薬工業)
9AA	:	9-アミノアクリジン(Sigma Chem. Co.)
2AA	:	2-アミノアントラセン(和光純薬工業)

AF2および2AAはDMSOに溶解したものを-20℃で凍結保存し，用時解凍した．9AAはDMSOに，SAは超純水に溶解し，速やかに試験に用いた．

〔培地および S9 mix の組成〕

1)　トップアガー(TA菌株用)

下記の水溶液(A)および(B)を容量比10:1の割合で混合した．

(A)	バクトアガー(Difco)	0.6％
	塩化ナトリウム	0.5％
(B)*	L-ヒスチジン	0.5 mM
	D-ビオチン	0.5 mM

*:WP2 uvrA 用には，0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた．

2)　合成培地

培地は，極東製薬工業

製の最少グルコース寒天培地を用いた．なお，培地1 Lあたりの組成は下記のとおりである．

硫酸マグネシウム・7水和物	0.2 g
クエン酸・1水和物	2 g
リン酸水素二カリウム	10 g
リン酸一アンモニウム	1.92 g
水酸化ナトリウム	0.66 g
グルコース	20 g
バクトアガー(清水食品)	15 g

径90 mmのシャーレ1枚あたり30 mLを流して固めたものである．

3)　S9 mix

1 mL中下記の成分を含む

S9**	0.1 mL
塩化マグネシウム	8 μmol
塩化カリウム	33 μmol
グルコース-6-リン酸	5 μmol
NADH	4 μmol
NADPH	4 μmol
ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)	100 μmol

** :7週齢の Sprague-Dawley 系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および 5,6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製された S9(キッコーマン)を用いた．

〔試験方法〕

プレインキュベーション法３）により，S9 mix 無添加試験および S9 mix 添加試験を行った．

小試験管中に，被験物質調製液0.1 mL，リン酸緩衝液0.5 mL(S9 mix 添加試験においては S9 mix 0.5 mL)，検定菌液0.1 mLを混合し，37℃で20分間プレインキュベーションしたのち，トップアガー2 mLを加えて混和し，合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりに使用溶媒，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．各検定菌ごとに用いた陽性対照物質の名称および用量は各Table 中に示した．溶媒および陽性対照群は，同時に実施した他の試験と共通とした．培養は37℃で48時間行い，生じた変異コロニー数を算定した．抗菌性の有無については，肉眼あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌膜の状態から判断した．用いた平板は用量設定試験においては，溶媒および陽性対照群では3枚ずつ，各用量については1枚ずつとした．また，本試験においては，両対照群および各用量につき，3枚ずつを用い，それぞれの平均値と標準偏差を求めた．

〔判定基準〕

用いた5種の検定菌のうち，1種以上の検定菌の S9 mix 無添加試験あるいは S9 mix 添加試験において，被験物質を含有する平板上における変異コロニー数の平均値が，溶媒対照値の2倍以上に増加し，その増加に再現性および用量依存性が認められた場合に，当該被験物質は本試験系において変異原性を有するもの(陽性)と判定することとした．

結果および考察

〔用量設定試験〕

5-エチリデン-2-ノルボルネンについて50.0～5000 μg/プレートの範囲で公比を約3として，試験を実施した．その結果，S9 mix 無添加試験においては，すべての検定菌で150 μg/プレート以上で抗菌性が認められた．また，S9 mix 添加試験では TA1535 と TA98 では150 μg/プレート以上で，その他の検定菌では500 μg/プレート以上で抗菌性が認められた．

したがって，本試験における最高用量は，S9 mix 無添加試験については250 μg/プレートとし，S9 mix 添加試験については TA1535 と TA98 は250 μg/プレート，その他の検定菌は500 μg/プレートとした．

〔本試験〕

上記の最高用量に基づいて，それぞれ公比2で6用量を設定して2回の本試験を実施した(Table 1，2)．ただし，TA1535 と TA1537 の S9 mix 無添加試験，および TA100の S9 mix 添加試験では，本試験

において抗菌性のない用量が4用量に満たなかったため，最高用量をそれぞれ250 μg/プレートから 125 μg/プレートに，500 μg/プレートから250 μg/プレートに下げて，本試験

をやり直すとともに，本試験

を実施した．その結果，すべての検定菌において，2回の本試験とも溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加は認められなかった．

以上の結果に基づき，5-エチリデン-2-ノルボルネンは，用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した．

文献

1)	D.M. Maron, B.N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983).
2)	S. Venitt, C. Crofton-Sleigh, "Evaluation of Short-Term Tests for Carcinogens," eds. by F.J. de Serres, J. Ashby, Elsevier/North-Holland, New York 1981, pp. 351-360.
3)	T. Matsushima, T. Sugimura, M. Nagao, T. Yahagi, A. Shirai, M. Sawamura, "Short-Term Test Systems for Detecting Carcinogens," eds. by K.H. Norpoth, R.C. Garner, Springer, Berlin-Heidelberg-New York, 1980, pp. 273-285.

連絡先

試験責任者：澁谷　徹

試験担当者：原　　巧，川上久美子，堀谷尚古

(財)食品薬品安全センター　秦野研究所

〒257-8523　秦野市落合 729-5

Tel 0463-82-4751 Fax 0463-82-9627

Correspondence

Authors: Tohru Shibuya(Study Director)
Takumi Hara, Kumiko Kawakami,
Naoko Horiya

Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center

729-5 Ochiai，Hadano-shi，Kanagawa 257 Japan

Tel +81-463-82-4751 FAX +81-463-82-9627

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