4-クロロ-o-クレゾールの細菌を用いる復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of 4-Chloro-o-cresol on Bacteria

要約

OECD既存化学物質安全性点検に係わる毒性調査事業の一環として，4-クロロ-o -クレゾールについてSalmonella typhimurium TA100, TA1535，TA98, TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAを用いる復帰突然変異試験をプレインキュベーション法により実施した.

予備試験における抗菌性の結果をもとに，本試験では S9 mix非共存下のWP2 uvrAについては1250～39.1 μg/プレート，その他の菌株については625～19.5 μg/プレートのそれぞれ公比２の6濃度を設定し，S9 mix共存下についてはいずれの菌株も1250～39.1 μg/プレートの公比２で6濃度を設定した．

本試験を 2回実施した結果，被験物質の各濃度において誘発された復帰変異コロニー数は，いずれの菌株においても陰性対照値の2倍以上を示さなかった．また，抗菌性がS9 mix非共存下では625 μg/プレート以上で，S9 mix共存下ではTA1535, WP2 uvrAは1250 μg/プレートで，その他の菌株は625 μg/プレート以上で認められた．従って，4-クロロ-o -クレゾールの変異原性は，陰性と結論した.

方法

〔使用菌株〕

カリフォルニア大学 B. N. Ames教授より1983年5月27日に入手したSalmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537および東京大学医科学研究所松島教授より1985年10月14日に入手したEscherichia coli WP2 uvrAの5菌株を用いた．各使用菌株は超低温槽で-80℃以下に凍結保存した．

試験に際して，各凍結菌株を融解後 , その20 mlをニュートリエントブロス(Oxoid Nutrient Broth No.2, Unipath社) 25 gを1 lの精製水に溶解して作成した液体完全培地10 mlに接種し，37℃で8時間振盪培養した．培養終了後の菌懸濁液は菌濃度を測定した後，試験に使用した．

〔被験物質〕

4-クロロ-o -クレゾール(CAS No.：1570-64-5，ロット番号：FBY01, 純度：93.9%；東京化成工業(株))は分子量142.58，融点40℃，沸点220～225℃の白色結晶塊で通常の取り扱い条件では安定である．なお，本ロットについては試験期間中安定であることを確認した.

4-クロロ-o-クレゾールはジメチルスルホキシド(DMSO，ロット番号：603E2089，純度：99.7%，関東化学(株))を用いて最高濃度(50 mg/ml)の溶液を調製した後, 同溶媒で公比2で希釈したものを用いた．また，調製に際しては純度換算(93.9%)を実施した．なお，本試験の1 回目に調製した最高および最低濃度の溶液について濃度分析を実施し，いずれも所定濃度の100±5%以内であることを確認した．

〔陽性対照物質〕

陽性対照物質として下記のものを用いた．

AF-2	：	2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(純度：98.0%, 和光純薬工業(株))
NaN3	：	アジ化ナトリウム(純度：96.5%，和光純薬工業(株))
ENNG	：	N-エチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(純度：99.0%，Sigma Chemical Co.)
9-AA	：	9-アミノアクリジン(純度：99%，Sigma Chemical Co.)
2-AA	：	2-アミノアントラセン(純度：95.0%，和光純薬工業(株))

NaN3は注射用水((株)大塚製薬工場)に，その他はDMSOに溶解したものを使用した.

〔培地およびS9 mixの組成〕

1)　トップアガー

アミノ酸水溶液として，精製水を用いて D-ビオチン，L-ヒスチジンおよびL-トリプトファンの0.5 mM混合水溶液を調製し，これをろ過滅菌後, 冷蔵庫に保管した．精製水100 mlに対して，粉末寒天(Bacto-Agar；Difco社) 0.6 g, 塩化ナトリウム0.5 gの割合で加え，オートクレーブで滅菌し完全に溶解させた後, 上記のアミノ酸水溶液を1/10量加えて混和し, 約45℃に保温した．

2)　最少グルコース寒天平板培地

クリメディア AM-N培地(日清製粉(株))を購入し，使用した．なお，培地1 lあたりの組成は下記のとおりである．

硫酸マグネシウム七水塩	0.2g
クエン酸一水塩	2g
リン酸水素二カリウム無水塩	10g
リン酸－アンモニウム	1.92g
水酸化ナトリウム	0.66g
ブドウ糖	20g
寒天（OXOID Agar No.1)	15g

径 90 mmのシャーレ1枚あたり30 mlを流して固めてある．

3)　S9 mix

S9 mix 1 mlあたり以下の組成で調製し，使用時まで氷中に保存した．

S9*	0.1ml
塩化マグネシウム六水塩	8μmol
塩化カリウム	33μmol
D-グルコース6-リン酸	5μmol
b-NADPH	4μmol
b-NADH	4μmol
ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)	100μmol
滅菌精製水	残量

*：	購入したS9(キッコーマン(株))を使用した．このS9は，7週齢の雄のSD系ラットにフェノバルビタールと5,6-ベンゾフラボンを併用投与して作製した肝ホモジネートの9000×g遠心上清分画である．

〔試験方法〕

試験はプレインキュベーション法で実施した．

試験管に被験物質溶液 0.1 mlを分注し，S9 mix 0.5 mlと菌懸濁液0.1 mlを加え，37℃で20分間振盪し，プレインキュベーションを行った．S9 mixを共存させない場合には，S9 mixの代わりに0.1 Mナトリウム－リン酸緩衝液(pH 7.4) 0.5 mlを加えた．プレインキュベーション後, トップアガー2 mlを上記の試験管に加えて混和し，最少グルコース寒天平板培地に重層した．重層したトップアガーが凝固した後，37℃で48時間培養し，復帰変異コロニー数を数えた．同時に実体顕微鏡を用いてバックグランドの菌の生育を観察し，被験物質による抗菌性の有無を調べた．予備試験は各濃度あたり1 枚のプレートを使用した．本試験は各濃度あたり3枚のプレートを用い，2回実施した．また，被験物質溶液の代わりに陰性対照物質(溶媒)および各菌株毎の陽性対照物質を用いて，被験物質群と同様の操作を行う対照群を設けた．

〔試験結果の判定基準〕

被験物質処理プレートにおける復帰変異コロニー数 (平均値)が陰性対照値の2倍以上を示し，明確な用量相関性および再現性が認められる場合に陽性と判定した．

結果および考察

〔予備試験〕

5000, 2500, 1250, 625, 313, 156, 78.1, 39.1 μg/プレートの濃度で実施したところ，S9 mix非共存下ではすべての菌株の625 μg/プレート以上で，S9 mix共存下ではWP2 uvrAの1250 μg/プレート以上および他の菌株の625 μg/プレート以上でそれぞれ抗菌性が認められた．ただし，S9 mix非共存下におけるWP2 uvrAの625 μg/プレートでの抗菌性は他の菌株に比べ弱いものであった．従って, 本試験ではS9 mix非共存下の WP2 uvrAについては1250, 625, 313, 156, 78.1, 39.1 μg/プレートの6濃度を，その他の菌株については625, 313, 156, 78.1, 39.1, 19.5 μg/プレートの6濃度を設定した．S9 mix共存下ではすべての菌株について1250, 625, 313, 156, 78.1, 39.1 μg/プレートの6濃度を設定した．

〔本試験〕

結果を Table 1, 2に示した．上記の濃度範囲で試験を実施したところ，2回の本試験とも各菌株の復帰変異コロニー数は，S9 mix非共存下および共存下のいずれにおいても，陰性(溶媒)対照値の2倍以上を示さなかった．また，抗菌性がS9 mix非共存下では625 μg/プレート以上で，S9 mix共存下ではTA1535, WP2 uvrAは1250 μg/プレートで，その他の菌株は625 μg/プレート以上で認められた．

以上の結果から , 4-クロロ-o-クレゾールの変異原性は陰性と結論した．

参考文献

1)	D. M. Maron and B. N. Ames, Mutation Research, 113, 173-215 (1983).
2)	M. H. L. Green and W. J. Muriel, Mutation Research, 38, 3-32 (1976).

連絡先

試験責任者：西冨　保

試験担当者：水野文夫，榎本佳明，石毛裕子
藤代洋子，村田久美，鈴木美江

（株）三菱化学安全科学研究所鹿島研究所

〒3l4-02茨城県鹿島郡波崎町砂山l4

Tel 0479-46-287l Fax 0479-46-2874

Correspondence

Authors: Tamotsu Nishitomi(Study director)
Fumio Mizuno, Yoshiaki Enomoto, Yuko Ishige,
Yoko Fujishiro, Kumi Murata, Yoshie Suzuki

Mitsubishi Chemical Safety Institute Ltd., Kashima Laboratory

14 Sunayama, Hasaki-mach, Kashima-gun, Ibaraki, 314-02, Japan

Tel ＋8l-479-46-287l Fax ＋8l-479-46-2874

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