4−エトキシベンゼナミンのマウスを用いる小核試験

Micronucleus Test of 4-Ethoxybenzenamine on Mice

要約

被験物質4−エトキシベンゼナミンの生体内における細胞遺伝学的影響を評価するために、Crj: BDF1雄および雌マウスを用いる強制経口投与による小核試験を実施した。結果は以下のように要約される。

1.毒性予備試験

4−エトキシベンゼナミンの毒性予備試験を行った結果、Crj: BDF1雄および雌マウスにおける最大耐量は、それぞれ600 mg/kgおよび1000 mg/kgであった。そこで、小核予備試験および小核本試験における4−エトキシベンゼナミンの高用量を雄は600 mg/kgとし、雌は1000 mg/kgとした。

2.小核予備試験

4−エトキシベンゼナミンの600 mg/kgを雄に、また、1000 mg/kgを雌に投与し、投与後24、48および72時間目に骨髄の塗抹標本を作製した。標本観察の結果、小核出現頻度（小核を有する多染性赤血球の割合）は、雄および雌ともに24時間群において最高値を示した。網赤血球の比率を指標とした骨髄細胞の増殖抑制は、雄雌ともに認められなかった。これらの結果から、小核本試験での標本作製時期（投与から標本作製までの時間）を、雄および雌ともに投与後24時間に決定した。

3.小核本試験

雄マウスには4−エトキシベンゼナミンの150、300および600 mg/kgを、また、雌マウスにはの250、500および1000 mg/kgを投与し、投与後24時間目に骨髄の塗抹標本を作製した。標本観察の結果、小核出現頻度は、雄において、いずれの検体投与群とも溶媒対照群と比較し、統計学的に有意な増加は観察されなかった。一方、雌においては1000 mg/kg投与群における小核出現頻度が溶媒対照群と比較して有意に増加した。赤血球中に占める網赤血球の比率は、雄雌ともにいずれの投与群においても、顕著な低下を示さなかった。

4.結論

以上の結果から、4−エトキシベンゼナミンは、本試験条件下で、BDF1雌マウスにおいて1000 mg/kgの投与により骨髄細胞に、小核を誘発する作用があることを示した。また、骨髄細胞の増殖抑制作用は、雄雌ともに示さなかった。

緒言

高生産量既存化学物質で、現在十分な安全性資料のない4−エトキシベンゼナミンについて、ＯＥＣＤを中心として行われている国際協力による安全性点検事業の一環として、生体内における細胞遺伝学的影響を調べるために、雄および雌マウスを用いて骨髄細胞における小核試験を実施した。まず、小核本試験に用いる投与量を決定するために毒性予備試験を行って最大耐量を求め、次に本試験における標本作製時期を決定するために小核予備試験を行い、それらの結果に基づいて、小核本試験を行った。この試験は「新規化学物質に係る試験の方法について」（昭和62年3月31日、環保業第237号、薬発第306号、62基局第303号）およびOECD化学品試験法ガイドライン：474に準拠し、化学物質GLP（昭和59年3月31日、環保業第39号、薬発第229号、59基局第85号、改訂昭和63年11月18日、環企研第233号、衛生第38号、63基局第823号）に基づいて実施した。

実験材料

1.実験動物と飼育条件

実験には、日本チャールス・リバー（CRJ）から購入した8週齢のCrj: BDF1（C57BL/6とDBA/2の近交系間F1）雄および雌マウスを、1週間以上予備飼育した後、異常の認められなかった動物を9〜10週齢で試験に供した。

動物は、床敷としてホワイト・フレーク（CRJ）を入れたTPX樹脂製ケージ（143×293×148 mm, CRJ）に1匹ずつ収容し、バリアーシステムの飼育室（設定室温：23±1℃、設定湿度：55±5%、換気回数：約15回／時間、明暗サイクル：午前7時点灯、午後7時消灯）で、マウス繁殖用固型飼料（ＮＭＦ、オリエンタル酵母工業）と水道水を自由に摂取させて飼育した。動物の群分けは無作為抽出により行った。個体識別はマウスの尾にフェルトペンでマークし、ケージには群ごとに色の異なるカードに、群および個体番号を記載して個体識別の補助とした。投与時の体重は雄で23〜29ｇ、雌で19〜24ｇであった。

2.被験物質

（名称）4−エトキシベンゼナミン
（4-Ethoxybenzenamine）
（CAS No.）156-43-4
（別名）p-Aminophenetol, p-Ethoxyaniline, p-Phenetidine
（ロット番号）FBV01（東京化成工業 (株) 製）
（分子式）C8H11NO
（分子量）137.18
（性状）液体、水に難溶、アルコールに可溶、沸点250℃、融点4℃
（比重）1.0652
（純度）98%以上
（提供者）(社) 日本化学工業協会
（入手年月日）1991年7月17日
（保管条件）気密容器で遮光

毒性予備試験

1.方法

1)実験群の設定

小核試験に用いる被験物質 4−エトキシベンゼナミンの投与量を決定するため、雄雌ともに各5匹ずつからなる8群を設け、投与量をそれぞれ、0〔溶媒対照：（局）オリブ油（和光純薬工業）〕、100、200、400、600、800、1000および1500 mg/kgとした。

2)検体の調製と投与方法

検体の投与容量はマウスの体重kg当たり10 mlとした。最高用量の投与検体は被験物質 4−エトキシベンゼナミンの所要量を精秤し、（局）オリブ油に懸濁して調製した。それ以下の用量については、最高用量の調製液を（局）オリブ油で希釈して所定の濃度になるよう調製した。また、投与検体はすべて用時調製とした。投与は単回強制経口投与とした。

3)死亡率、一般状態の観察および体重測定

投与当日を0日として4日間にわたり毎日一般状態を観察し、死亡の有無を調べた。また、マウスの体重を投与時と3日目の観察終了時に測定した。

2.結果

1)死亡率、一般状態および体重推移

溶媒のみを投与した群では、雄雌ともに一般状態に変化は見られず、体重もわずかに増加した。一方、4−エトキシベンゼナミンを投与した群では、雄および雌とも、400 mg/kg以上の投与群で自発運動の低下が認められ、用量の増加とともに、伏臥、横臥、呼吸促迫および立毛などの毒性徴候が現れた。死亡例は、雄は800および1500 mg/kg投与群でみられ、雌では1500 mg/kg群でのみみられた。生存個体においては、雄の800 mg/kg、雌の1000 mg/kg以上の投与群で明らかな体重の減少が認められた。以上の結果から、4−エトキシベンゼナミンの単回強制経口投与によるBDF1雄および雌マウスの最大耐量はそれぞれ600 および1000 mg/kgであると結論された。

2)小核試験に用いる投与量

小核予備試験および小核本試験に用いる4−エトキシベンゼナミンの高用量を、雄は600 mg/kgとし、雌は1000 mg/kgに決定した。また、これをもとにして、公比2で減じ、雄では中用量を300 mg/kg、低用量を150 mg/kgとし、雌では中用量を500 mg/kg、低用量を250 mg/kgにそれぞれ決定した。

小核予備試験

1.方法

1)実験群の設定

本試験における適切な標本作製時期を決定するために、雄雌ともに各5匹ずつからなる3群（24時間群、48時間群、72時間群）を設けた。投与量は雄および雌マウスにおいて、それぞれ高用量の600 mg/kgおよび1000 mg/kgとした。

2)検体の調製と投与方法

検体の調製と投与方法は毒性予備試験の場合と同様に行った。投与は、単回強制経口投与とした。

3)標本の作製

小核の観察のための標本を、Schmidの方法1, 2）に従って作製した。すなわち、投与後所定の時間に頸椎脱臼法によりマウスを致死させて左右の大腿骨を摘出した。その両骨端を切断して、骨髄細胞を0.6 mlのウシ胎児血清（Hazleton）で洗い出し、遠沈管に集め、1000 rpmで5分間遠心分離して、上清を除いた。沈渣をピペッティング後、細胞浮遊液の一部をスライドグラス上に塗抹（各個体につき2枚の標本）し、一夜、室温で風乾した。乾燥した骨髄標本は5分間メタノールで固定し、ギムザ染色〔pH 6.8のリン酸緩衝液で5%に希釈したギムザ液（Mer-ck）で25分間〕を行った後、pH 6.8のリン酸緩衝液、0.004%クエン酸水溶液および蒸留水で順次すすぎ、風乾した。

また、網赤血球（reticulocytes）の観察のためにニューメチレンブルーによる超生体染色を行った。すなわち、上記操作で遠沈管に残った細胞浮遊液に同量のニューメチレンブルー液（ニューメチレンブルー0.5gとシュウ酸カリウム1.6 gを100 mlの蒸留水に溶かしたもの）を加え約3分間染色した。次に、小核の標本作製の場合と同様にスライドグラス上に塗抹（各個体につき2枚の標本）し、一夜風乾後メタノールで固定し、上記ギムザ液で25分間染色し、pH 6.8のリン酸緩衝液および蒸留水で順次すすぎ、風乾した。

4)小核の観察

作製したそれぞれの骨髄標本に暗番号を記し、雄雌それぞれについて、2名の観察者によりブラインド法で観察した。1個体あたり2000個の多染性赤血球（polychromatic erythrocytes）を観察し、その中の小核を有するものの数を記録した。また赤血球を1個体あたり1000個観察し、そのなかの網赤血球の比率を調べて、骨髄細胞の増殖抑制の指標とした。

5)有意差検定

雄雌それぞれの小核出現頻度について、Kastenbaum and Bowman（1970）3）の表により、24時間群と他の群との間で5%水準で有意差検定を行った。くり返し検定に伴う多重性は考慮しなかった。

2.結果

雄および雌の小核予備試験の結果をそれぞれTable 1および 2 に示す。小核出現頻度は、雄雌ともに24時間群において最高値を示した。また、網赤血球の比率を指標とした骨髄細胞の増殖抑制は、雄雌ともに認められなかった。以上の結果から、小核本試験における標本作製時期は、雌雄ともに投与後24時間に決定した。

小核本試験

1.方法

1)実験群の設定

毒性予備試験の結果に基づき、雄雌ともに各5匹ずつからなる5群を以下のように設けた。また、高用量群に死亡が見られた場合の予備個体として、雄および雌に600 mg/kgおよび1000 mg/kgをそれぞれ別の2匹に投与した。

雄

1)溶媒対照群（オリブ油）
2)4−エトキシベンゼナミン 150 mg/kg投与群
3)4−エトキシベンゼナミン 300 mg/kg投与群
4)4−エトキシベンゼナミン 600 mg/kg投与群
5)陽性対照群（cyclophosphamide, CPA：50 mg/kg）*

雌

1)溶媒対照群（オリブ油）
2)4−エトキシベンゼナミン 250 mg/kg投与群
3)4−エトキシベンゼナミン 500 mg/kg投与群
4)4−エトキシベンゼナミン 1000 mg/kg投与群
5)陽性対照群（cyclophosphamide, CPA：50 mg/kg）*

* 当研究室で、本用量のCPAの強制経口投与により小核が有意に誘発されることが認められている。

2)検体の調製と投与方法

投与検体の調製および投与方法は毒性予備試験の場合と同様に行った。また、陽性対照物質（CPA、Sigma）は、局方生理食塩液（小林製薬工業）に溶解して所定の濃度に調製した。投与は、単回強制経口投与とした。

なお、当研究所で調製検体の室温における安定性試験を実施した。すなわち、4−エトキシベンゼナミンを（局）オリブ油に懸濁して15 mg/ml溶液（投与容量をマウスの体重当たり10 mlとした場合に150 mg/kgに相当）および100 mg/ml溶液（同1000 mg/kgに相当）を調製し、分析化学研究室で高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて、調製直後および2日後の含量を測定した。その結果、両調製検体の調製2日後の平均含量比は調製時のそれぞれ96.6および98.0%であった。したがって、小核本試験で用いた濃度範囲における調製検体は、室温で調製後2日間安定であることが確認された。

また、小核本試験における、高用量群および低用量群の投与検体について、HPLCを用いて均一性・含量分析を行った。その結果、被験物質の平均含量は添加量の101〜114%の範囲にあり、サンプル間のばらつきは平均値の10%以内であった。これらの値は当研究所の標準操作手順書の基準（懸濁液検体の平均含量は添加量の85%以上、検体測定値のばらつきは、それらの平均値±10%以内）を満たしていた。

3)標本の作製方法および小核の観察

標本の作製および小核の観察は、小核予備試験の場合と同様に行った。ただし、標本の作製時期は小核予備試験の結果に基づき、雄雌ともに投与後24時間に行った。

4)有意差検定

小核出現頻度について、Kastenbaum and Bowmanの表により、雄雌につきそれぞれ溶媒対照群と、4−エトキシベンゼナミンの各投与群および陽性対照群との間で5%水準で有意差検定を行った。くり返し検定に伴う多重性は考慮しなかった。更に、小核出現頻度の用量（対数値）依存性について、Cochran-Armitageの傾向検定4, 5）を5%水準で行った。

また、赤血球中に占める網赤血球の比率について、雄雌につきそれぞれ溶媒対照群と、4−エトキシベンゼナミンの各投与群および陽性対照群との間で5%水準でｔ検定を行った。くり返し検定に伴う多重性は考慮しなかった。

2.小核本試験の結果および考察

雄および雌の小核本試験の結果を、それぞれTable 3および4に示す。小核出現頻度は、雄についてはKastenbaum and Bowmanの表を用いた有意差検定の結果、いずれの投与群も溶媒対照群との間に有意な差は認められなかった。また、Cochran-Armitageの傾向検定の結果においても、4−エトキシベンゼナミンの用量に依存した有意な増加傾向を示さなかった。小核予備試験（Table 1）においては、小核本試験と同じ　600 mg/kgの24時間群の値（0.47%）は、当研究所が過去5年間に52回実施した、BDF1雄マウスを用いた小核試験の溶媒対照群の値の変動範囲（0.04〜0.23%）を明らかに越えていたが、本試験においては統計学的な有意差が認められなかった。したがって、4−エトキシベンゼナミンの雄マウスにおける小核誘発性については、明らかでなかった。

一方、雌の小核出現頻度は、Kastenbaum and Bowmanの表を用いた有意差検定の結果、4−エトキシベンゼナミンの1000 mg/kg投与群の値が、溶媒対照群より有意に高かった。また、Cochran-Armitageの傾向検定でも、4−エトキシベンゼナミンの用量に依存した増加傾向を示した。また、この小核出現頻度の値（0.58%）は、当研究所が過去5年間に14回実施した、BDF1雌マウスを用いた小核試験の溶媒対照群の値の変動範囲（0.04〜0.24%）を明らかに越えていた。さらに、小核予備試験の結果（Table 2）を考え合わせると、1000 mg/kgの4−エトキシベンゼナミンは雌マウスの骨髄細胞において小核を誘発すると考えられる。一方、CPAを50 mg/kg投与した陽性対照群での小核出現頻度は雄雌ともに5%水準で有意な増加がみられた。

赤血球中に占める網赤血球の比率は、雄雌ともに、4−エトキシベンゼナミンのいずれの投与群においても溶媒対照群との間に有意な差は認められなかった。

文献

1)W. Schmid, Mutation Res. 31 , 9-15 (1975)
2)W. Schmid, "Chemical Mutagens", Vol.4, ed. by A.Hollaender, Plenum Press, N.Y.-London , 1976,
pp.31-53.
3)M.A.Kastenbaum and K.O.Bowman, Mutation Res. 9, 527-549 (1970).
4)Cochran, W.G. : Biometrics 10, 417-451 (1954).
5)P.Armitage, Biometrics, 11, 375-386 (1955).

連絡先：
試験責任者澁谷徹
（財）食品薬品安全センター秦野研究所
〒257 神奈川県秦野市落合 729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence:
Shibuya, Tohru
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257, Japan
Tel 81-463-82-4751Fax 81-463-82-9627