検定菌として，Salmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA15371)およびEscherichia coli WP2 uvrA2)の5菌株を用い，S9 mix無添加条件および添加条件のいずれも，用量設定試験で生育阻害が認められなかったことから，本試験はS9 mix無添加条件および添加条件ともに313〜5000 μg/plateの範囲で実施した．
その結果，用いた5種の検定菌のいずれの用量においても，陰性対照値の2倍以上となる復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．
以上の結果から3,3-ビス(p-ジメチルアミノフェニル)-6-ジメチルアミノフタリドは，用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した．
3,3-ビス(p-ジメチルアミノフェニル)-6-ジメチルアミノフタリドは，ジメチルスルホキシド(DMSO，ロット番号:SEG4422，和光純薬工業(株))に溶解して最高用量の調製液を調製した後，同溶媒で所定の濃度に希釈して速やかに試験に用いた．調製時に，発熱，発泡，変色等の変化はみられなかった．
各検定菌ごとに用いた陽性対照物質は，当研究所で十分な蓄積データが得られている物質および用量とし，それぞれTable中に示した．
| 2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(AF2，和光純薬工業(株)) |
| アジ化ナトリウム(SA，和光純薬工業(株)) |
| 9-アミノアクリジン(9AA，Sigma Chem. Co.) |
| 2-アミノアントラセン(2AA，和光純薬工業(株)) |
AF2，9AAおよび2AAはDMSOに，SAは超純水に溶解したものを-20 ℃で凍結保存し，解凍後，速やかに試験に用いた．
S. typhimuriumの4菌株は1997年8月7日に，E. coli WP2 uvrA株は1997年4月9日に日本バイオアッセイ研究センターの松島泰次郎博士から分与された．
検定菌は-80 ℃で凍結保存したものを用い，各菌株の特性確認は凍結保存菌の調製時に，アミノ酸要求性，UV感受性，膜変異(rfa)，アンピシリン耐性因子pKM101(プラスミド)の有無および陰性対照群と陽性対照群の復帰変異コロニー数について調べ，特性が維持されていることを確認した．
試験に際して，ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid Ltd.)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し，37 ℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした．
分光光度計により660 nmの吸光度を測定し，検定菌液の増殖を確認した．
| 硫酸マグネシウム・7水和物 | 0.2 g |
| クエン酸・1水和物 | 2 g |
| リン酸水素二カリウム | 10 g |
| リン酸一アンモニウム | 1.92 g |
| 水酸化ナトリウム | 0.66 g |
| グルコース | 20 g |
| 大洋寒天(清水食品(株)) | 15 g |
径90 mmのシャーレ1枚あたり30 mLを流して固めたものである．
| (A) | バクトアガー(Difco Lab.) | 0.6 w/v% |
| 塩化ナトリウム | 0.5 w/v% | |
| (B) | Salmonella typhimurium用 | |
| L-ヒスチジン | 0.5 mmol/L | |
| D-ビオチン | 0.5 mmol/L | |
| (C) | Escherichia coli用 | |
| L-トリプトファン | 0.5 mmol/L | |
| S9* | 0.1 mL |
| 塩化マグネシウム | 8 μmol |
| 塩化カリウム | 33 μmol |
| グルコース-6-リン酸 | 5 μmol |
| NADH | 4 μmol |
| NADPH | 4 μmol |
| ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4) | 100 μmol |
| * | : | 7週齢のSprague-Dawley系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および5,6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製したS9(キッコーマン(株))を用いた． |
小試験管中に，被験物質調製液0.1 mL，0.1 mol/Lナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)0.5 mL(S9 mix添加条件においてはS9 mix 0.5 mL)，検定菌液0.1 mLを混合し，37 ℃で20分間プレインキュベーションしたのち，約45 ℃に保温したトップアガー2 mLを加えて混和し，合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりに使用溶媒，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．同時に実施した他試験については，陰性および陽性対照群を共通とした．
培養は37 ℃で48時間行い，発生した復帰変異コロニー数をコロニーアナライザーまたは目視によって算定した．被験物質に由来する沈澱の有無は，肉眼により確認した．また，生育阻害の有無については，肉眼あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌叢の状態から判断した．用いた平板は用量設定試験においては，陰性および陽性対照群では3枚ずつ，各用量については1枚ずつとした．また，本試験においては，両対照群および各用量につき，3枚ずつを用い，それぞれの平均値と標準偏差を求めた．
用量設定試験は1回，本試験は同一用量について2回実施し，結果の再現性の確認をした．
したがって，S9 mix無添加条件および添加条件とも最高用量を5000 μg/plateとして公比2で5用量を設定して2回の本試験を実施した(Table 1, 2)．その結果，2回の試験とも陰性対照値の2倍以上となる復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．
以上の結果に基づき，3,3-ビス(p-ジメチルアミノフェニル)-6-ジメチルアミノフタリドは，用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した．
なお，3,3-ビス(p-ジメチルアミノフェニル)-6-ジメチルアミノフタリドは，当研究所で本試験と並行して実施したチャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験でも陰性の結果が得られている4)．また，関連物質であるN,N,N',N'-テトラメチル-p-フェニレンジアミンについては染色体異常試験で陽性の5)，無水フタル酸については復帰変異試験で陰性の結果が得られてい る6)．
| 1) | D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983). |
| 2) | M. H. L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures," eds. by B. J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp. 161-187. |
| 3) | T. Matsushima, T. Sugimura, M. Nagao, T. Yahagi, A. Shirai, M. Sawamura, "Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens," eds. by K. H. Norpoth, R. C. Garner, Springer, Berlin, 1980, pp. 273-285. |
| 4) | 佐々木澄志，化学物質毒性試験報告，10, 208(2003). |
| 5) | 祖父尼俊雄 監修，"染色体異常試験データ集，"エル・アイ・シー，東京，1999，p. 487. |
| 6) | 労働省労働基準局安全衛生部化学物質調査課監修，"労働安全衛生法有害性調査制度に基づく既存化学物質変異原性試験データ集，"日本化学物質安全・情報センター，東京，1996，p. 227. |
| 連絡先 | |||
| 試験責任者： | 原 巧 | ||
| 試験担当者： | 須井 哉，三枝克彦，加藤初美 | ||
| (財)食品薬品安全センター秦野研究所 | |||
| 〒257-8523 秦野市落合729-5 | |||
| Tel 0463-82-4751 | Fax 0463-82-9627 | ||
| Correspondence | ||||
| Authors: | Takumi Hara(Study Director) Hajime Sui, Katsuhiko Saegusa, Hatsumi Kato | |||
| Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center | ||||
| 729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257-8523, Japan | ||||
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