ピグメントグリーン No.7のラットを用いた28日間反復投与毒性試験
Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of Pigment Green No.7 in Rats
要約
ピグメントグリーン No.7の20，140および1000 mg/kgをSD系ラットの雌雄に28日間反復投与し，その毒性について検討した．対照群および1000 mg/kg群については14日間の回復期間を設けた．
全観察期間を通して死亡例は認められず，一般状態にも異常は認められなかった．また，体重，摂餌量，血液学的検査，血液生化学的検査，尿検査および病理学的検査においても，被験物質投与に起因する変化は認められなかった．
以上の結果より，本試験条件下におけるピグメントグリーン No.7の無影響量は雌雄ともに1000 mg/kgと考えられる．
方法
1. 被験物質
ピグメントグリーン No.7（大日精化工業（株），ロット番号：92.10.9，純度：99.04％）は，分子量1127.2，水およびアセトン，DMSOなどの有機溶媒に不溶の緑色粉末である．本ロットについては試験期間中安定であることが確認された．
2．試験動物およぴ飼育条件
日本チャールスリバー（株）より入手したSD系ラット（Crj:CD，SPF）の雌雄を5日間検疫・馴化し，試験に使用した．投与開始前に動物を体重別層化無作為抽出法により群分けした．1群の動物数は雌雄各6匹とし，対照および高用量群についてはこの他に雌雄各6匹の回復群を設けた．投与開始時の週齢は雌雄とも5週齢，体重範囲は雄が134〜156 g，雌が109〜138 gであった．
検疫・馴化期間を含めた全飼育期間中，温度20〜25℃，湿度40〜70％R.H.，換気約12回／時，照明12時間（7:00〜l9:00）に自動調節された飼育室を使用した．動物は，実験動物用床敷（べ一タチップ：日本チャールス・リバー（株））を敷いたポリカーボネート製ケージに1ケージ当り2匹で収容し飼育した．
動物には，実験動物用固型飼料（MF：オリエンタル酵母（株）〉および5 mmのフィルター濾過後紫外線照射した水道水を，それぞれ自由摂取させた．
3．投与量および投与方法
被験物質を0，100，300および1000 mg/kgの各用量でSD系ラットに7日間反復経口役与した結果，1000 mg/kgの雌で軽度の体重増加抑制がみられた以外に明瞭な毒性兆候は認められなかった．従って，本試験では高用量を1000 mg/kgとし，以下公比約7で中および低用量をそれぞれ140 mg/kg，20 mg/kgとした．さらに，溶媒のみを投与する対照群を設定した．投与期間は剖検前日までの28日間とし，対照および1000 mg/kg群については14日間の回復期間を設けた．被験物質をオリーブ油に懸濁させ，毎日1回，午前中に胃ゾンデを用いて強制経口役与した．投与液量は10 ml/kgとし，至近測定日の体重を基に算出した．
4．観察および検査方法
1） 一般状態．体重および摂餌量
全例について一般状態を毎日観察した．体重は役与開始日およびその後毎週1回測定した．また摂餌量については投与開始日およびその後毎週1回，ケージ単位で風袋込み重量を測定し，各期間毎の1匹当りの1日の平均摂餌量を算出した．
2）血液学的検査
各計画殺時の全動物について，チオペンタールナトリウムの腹腔内投与による麻酔下で後大静脈より採血し，赤血球数（シースフローDCインピーダンス検出法），白血球数（RF/DCインピーダンス検出法），血小板数（シースフローDCインピーダンス検出法），ヘモグロビン濃度（SLSヘモグロビン法），ヘマトクリット値（赤血球パルス波高値検出法）を多項目自動血球分析装置（NE-4500：東亞医用電子（株）），白血球百分率（Wright染色塗抹標本）を血液細胞自動分析装置（MICROXHEG-70A：（株）立石電機）．網状赤血球数（アルゴンレーザーを用いたフローサイトメトリー法）を自動網赤血球測定装置（R-2000：東亞医用電子（株）），プロトロンビン時間（PT；Quick一段法），活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT；活性化セファロプラスチン法）を血液凝固自動測定装置（KC-10A：アメルング社）により測定した．また，検査の結果から平均赤血球容積（MCV），平均赤血球血色素量（MCH），平均赤血球血色素濃度（MCHC）を算出した．凝固阻止剤として，プロトロンビン時間および活性化部分トロンボプラスチン時間測定には3.13％クエン酸ナトリウム水溶液を，それ以外の項目の測定にはEDTA-2Kを用いた．
3）血液生化学的検査
採取した血液を室温で約30分間放置した後，3000 r.p.m.，10分間遠心分離し，得られた血清を用いて総蛋白（Biuret法），アルプミン（BCG法），A/G比（総蛋白およびアルブミンより算出），グルコース（GK-G6PDH法），トリグリセライド（LPL-GK-G3PO-POD法），総コレステロール（CES-CO-POD法），尿素窒素（Urease-GLDH法），クレアチニン（Jaff
法），カルシウム（O-CPC法），無機リン（UV法），GOT（SSCC改良法），GPT（SSCC改良法），γ-GTP（SSCC改良法），ALP（GSCC改良法），ナトリウム，カリウム，クロライド（イオン選択電極法）を自動分析装置（日立736-10形：（株）日立製作所）により測定した．
4）尿検査
投与終了時の解剖の4日前に全動物の新鮮尿を採取し，pH，潜血，蛋白，糖，ケトン体，ビリルピン，ウロビリノーゲン（試験紙法，N-マルチスティックスSG：マイルス・三共（株））を尿分析器（クリニテック10：マイルス・三共（株））により測定した．
5）病理学的検査
各計画殺時，全動物について採血後に腹大動脈を切断して放血致死させ剖検し，脳，肝臓，腎臓，副腎，精巣および卵巣の重量を測定した．また，これらの器官に加え，下垂体，眼球（付属腺を含む），肺，胃，甲状腺（上皮小体を含む），心臓，脾臓，膀胱，骨髄（大腿骨）を採取し，10％中性リン酸綬衝ホルマリン液（眼球およびハーダー腺はDavidson液）にて固定後，保存した．
投与終了時解剖動物の対照および1000 mg/kg群の雌雄の心臓，肝臓，腎臓，副腎および脾臓を対象に，常法に従いヘマトキシリン・エオジン染色標本を作製し鏡検した．
6．統計学的解析
計量データについては，Bartlett法による等分散の検定を行い，分散が一様の場合は一元配置分散分析を行った後，Dunnett法またはScheff法により平均値の比較を行った．分散が一様でない場合にはKruskal-Wallisの検定を行い，Dunnett型またはScheff型の順位和検定を行った．尿の定性検査で得られたデータについては，Armitageのx2検定を用いた．有意水準は5％以下とした．
結果
1．一般状態．体重および摂餌量（Fig. 1,2）
雌雄ともに死亡は認められず，一般状態にも異常は認められなかった．また，体重および摂餌量についても各被験物質役与群とも対照群とほぽ同様な推移を示した．
2．血液学的検査（Table 1）
投与終了時の検査において，20 mg/kg群の雌で血小板数の減少がみられ，回復終了時の検査では，1000 mg/kg群の雄でプロトロンビン時間の短縮が認められたが，これらは用量依存性のない変化か，あるいは軽微な変化であることから，生理的変動範囲内の偶発的変化と判断した．
3．血液生化学的検査（Table 2）
投与終了時の検査において，雄の140 mg/kg群でトリグリセライドの増加，1000 mg/kg群でナトリウムの減少が認められたが，これらは用量依存性のない変化か，あるいは軽微な変化であり，生理的変動範囲内の偶発的変化と判断した．回復終了時の検査では雌雄とも異常は認められなかった．
4．尿検査
雌雄とも異常は認められなかった．
5．器官重量（Table 3）
回復終了時の検査において，1000 mg/kg群の雌の卵巣重量が増加したが，対体重比では差は認められず，また，投与終了時の検査においても変化がなかったことから，偶発的変化と判断した．
6．病理解剖検査（Table 4）
被験物質投与に起因する変化は認められなかった．投与終了時の検査で，脾臓の灰白色斑，肺の出血巣，肝臓の横隔膜面結節，卵巣のう内漿液貯留，肺と胸壁との部分的な癒着が認められたが，これらの変化の発現状況には一定の傾向を欠くことから偶発的変化と判断した．回復終了時の検査では肉眼的異常は認められなかった．
7．病理組織学的検査（Table 5）
被験物質投与に起因する変化は認められなかった．雄の対照群および1000 mg/kg群の全例の腎臓で尿細管上皮内の硝子滴の出現がみられたが，いずれも軽度な変化であり両群間に程度の差はなかった．その他，心筋変性小巣，脾臓の髄外造血および限局性被膜炎，肝臓のび漫性脂肪化，腎臓の尿細管上皮の好塩性変化，腎のう胞，尿細管内硝子円柱が各群で散見されたが，発現状況に一定の傾向がなく偶発性変化と判断した．
8．結論
以上の結果から，本試験条件下におけるピグメントグリーン No.7の無影響量は雌雄ともにl000 mg/kgと考えられる．
| 連絡先 |
| 試験責任者： | 松浦郁夫 |
| 試験担当者： | 藤井佳代，土谷稔，山岸保彦，豊田直人 |
| （株）三菱化学安全科学研究所鹿島研究所 |
| 〒3l4-02茨城県鹿島郡波崎町砂山l4 |
| Tel 0479-46-287l | Fax 0479-46-2874 | |
| Correspondence |
| Authors: | Ikuo Matsuura（Study director）
Kayo Fujii,
Minoru Tsuchitani,
Yasuhiko Yamagishi,
Naoto Toyota |
| Mitsubishi Chemical Safety Institute Ltd., Kashima Laboratory |
| 14 Sunayama, Hasaki-mach, Kashima-gun, Ibaraki, 314-02, Japan |
| Tel ＋8l-479-46-287l | Fax ＋8l-479-46-28743 | |