銅フタロシアナ−トの28日間反復投与毒性試験

Twenty-eight Day Repeat Dose Toxicity Test of Phthalocyanine Blue in Rats

要約

既存化学物質安全性点検の一環として、銅フタロシアナ−ト（Phthalocyanine Blue）の0、40、200および1000 mg/kgをラットに28日間反復経口投与し、一般毒性学的影響を検討した。

被験物質の影響により死亡した例は、雌雄いずれの投与群にも観察されなかった。一般状態、体重及び摂餌量にも投与による影響は認められなかった。雄の血液学的検査において赤血球数の減少が、200および1000 mg/kg群に投与用量に依存して認められた。しかし、血清生化学的検査では、特定臓器に障害を示唆する変化は認められなかった。器官重量において、雄の1000 mg/kgの回復群で肺、脾臓、精巣、副腎、唾液腺に絶対重量の増加、相対重量で脾臓のみに増加が認められた。しかし、病理組織学的には、これらの臓器に投与によると考えられる変化は認められなかった。

以上の結果から、銅フタロシアナ−トの反復強制経口投与による影響は、200 mg/kg群以上で認められた軽度の赤血球系への影響で、NOELは40 mg/kgと推定される。

緒言

既存化学物質安全性点検の一環として、ラットを用いて一般毒性学的影響を検討した。

方法

1)動物及び飼育条件

日本エスエルシ−産のSlc:Wistarラットを7〜10日間の検疫・馴化飼育後、5週齢（雌：体重95.3〜111.1g、雄：体重101.8〜120.0g）で試験に供した。順調に発育した一般状態の良好な動物を体重層別無作為抽出法で各群の体重がほぼ等しくなるように割り付け、ポリカーボネイト製ケージにソフトチップ（三協ラボサービス）を敷き、1ケージ当たり5匹ずつ収容した。飼育は、24±1℃、55±5%に空調されたSPF動物室で行った。動物室の照明は午前5時から午後5時の12時間を点灯した。飼料は船橋農場製F-2を用い、水道水と共に自由に摂取させた。

2)被験物質

試験に用いた銅フタロシアナ−トは、大日本インキ株式会社製Phthalocyanine Blue（Technical grade）で、脂溶性の青色粉末である。

3)被験物質の投与量及び投与法

投与各群の用量と投与動物数は下表のように設定した。

被験物質はコーン油を溶媒として0.8 ml/100g体重の投与容量になるように各群ごとに濃度を調整し、週2回の測定体重を基に計算した投与量で、1日1回28日間午前10〜12時に繰り返し投与した。

4)観察及び検査

一般状態の観察は毎朝行い、死亡及び瀕死動物は発見後速やかに剖検した。体重と摂餌量は週2回（雄の第1週のみ3回）測定した。最終投与24時間後に対照およびL、M、H群の各5例、14日間の回復期間終了時に回復対照群と回復Ｈ群の各5例について、エーテル麻酔下で眼窩静脈叢より体重の1.7%以下の量の採血を行い、血液学的検査及び血清生化学的検査を行った。動物は採血後頸動脈より放血し、病理学的検査を行った。これらの検査を行った動物とは別のそれぞれの群の5例について同時期に、エーテル麻酔下で頸静脈より採血し、血液凝固能検査を行った。また、最終投与日の投与前日に強制排尿により、各群5例について、ウロラブスティクス（マイルス三共株式会社）を用いて尿検査（pH、蛋白、ウロビリノーゲン、ケトン体、ブドウ糖、潜血）を実施した。

(1)血液学的検査

採血した血液20μlをディスペンサーで取り希釈液セルパック（東亜医用電子株式会社）で500倍に希釈して、SYSMEX M-2000（東亜医用電子株式会社）でTable 1に示すRBC、Hb、MCV、WBC等を測定した。

同時に5〜6滴の血液を50μlの5% EDTA-2K水溶液で希釈し、スピナー（オムロン株式会社）を用いて塗抹標本を作製し、ライト染色を施してからMICROX HEG-120A（オムロン株式会社）にて白血球百分比を測定した。

血液凝固能検査は、3.8%クエン酸3ナトリウム溶液0.2 mlを入れた注射筒で頸静脈より2mlを採血し、遠心分離（3000r pm/10 min）により得られた血漿について、プロトロビン、活性部分トロンボプラスチンをKC-10（AHS/Japan Co.）にて測定した。

(2)血清生化学的検査

採血した血液を室温に10分間放置してから氷冷し、遠心分離（3000 rpm/10 min）して得た血清について、日立7150オートアナライザーでTable 1に示す項目について測定した。

(3)病理学的検査

頸動脈放血によりと殺した動物は速やかに剖検し、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、精巣、卵巣、副腎、唾液腺（顎下腺および舌下腺の一部）および胸腺の重量を測定し、これらに加えて下垂体、眼球、膀胱、大腿骨および肉眼的に変化の認められた臓器・組織を摘出し、10%中性緩衝ホルマリンで固定した。心臓、肝臓、脾臓、腎臓、副腎および肉眼的に変化の認められた臓器・組織について、常法に従ってパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を施し、病理組織学的検査を実施した。腎臓についてはPAS染色を施して検討を加えた。

5)統計学的処理

血液学的検査、血清生化学的検査、臓器重量の投与終了時の結果はBartlettの方法により分散の一様性の検定を行い、分散が一様の場合には、一元配置の分散分析を行なった。群間に有意性が認められ、各群の動物数が一定である場合Dannet法、不定の場合Scheffの方法によって対照群に対する各群の平均値の一対比較検定を行なった。等分散が認められない場合、Kruskal-Wallisの検定を行い、有意差が認められた場合は、対照群と各投与群間においてノンパラメトリックのDunnett法またはScheffの方法による検定を行った。回復期間終了時の結果および体重はｔ検定を行なった。

結果

1)一般状態および死亡

対照群の1例が22日に投与後30分以内に投与過誤により死亡した他に一般状態の変化や死亡は認められなかった。

2)体重および摂餌量（Fig.1〜2）

体重、摂餌量ともに対照群と投与群との間に差は認められず、投与による影響は認められなかった。

3)血液学的検査（Table 2）

雄の200と1,000 mg/kg群にRBCの用量に伴った減少が認められ、雌の40 mg/kg群にPCVの減少が認められた。

回復1,000 mg/kg群の雌でEbl、表には示していないがPDWとMPVの増加が認められた他に回復群で変化は認められなかった。

血液凝固能においては、すべての群で変化が認められなかった。

4)血液生化学的検査

雌の200 mg/kg群のNaに増加が認められる以外に雌雄で変化は認められなかった。

回復1,000 mg/kg群の雌でAlbとChEの増加が認められた他に回復群の雌雄で変化は認められなかった。

5)尿検査

すべての群で特記すべき変化は認められなかった。

6)病理学的検査

(1)剖検

投与22日に死亡した対照群雄（No.6）の剖検で、鼻出血、胸腺の点状出血、肺のうっ血、副腎のうっ血が認められ、肺の割面や気管内に投与検体と思われるオイル状の液体が認められ、投与過誤により死亡したものと考えられた。

《投与期間終了時》
雌雄とも200および1000 mg/kg群で数例の肺に軽度に青色物質の沈着が認められた。

《回復期間終了時》
雄の1000 mg/kg群の肺で1例に軽度に青色物質の沈着が認められた。

(2)臓器重量（Table 3〜4）

雄の200 mg/kg群の肺実重量に増加が認められた他に雌雄の実重量・比重量で変化は認められなかった。

雄の回復1,000 mg/kg群で、肺、脾臓、精巣、副腎、唾液腺の実重量と脾臓比重量の増加が認められた。雌の回復群では変化は認められなかった。

(3)病理組織学的検査

《投与期間終了時》
心臓：心筋への円形細胞浸潤が雄で対照群に1例、200 mg/kg・群に2例、1000 mg/kg群に1例認められた。

肺：雌雄とも気管支周囲への細胞浸潤ならびに肺胞壁の肥厚が対照群を含む各群で認められた。また、肺胞壁内に青い結晶物の沈着が雌の1000 mg/kg群を除いた、雌雄の検体投与群に1〜3例認められた。

肝臓：雌雄とも肝細胞に軽度な単細胞性壊死が対照群を含む各群で1〜4例認められた。

腎臓：雄で近位尿細管にエオジンに好染し、PAS染色で陰性を示す eosinophilic・body・が対照群を含む全例に認められた。また、雌では皮髄境界部に石灰沈着が対照群を含む各群で2〜4例認められた。

胃：雄で腺胃粘膜固有層から粘膜下織にかけてリンパ球の集積が200および1000 mg/kg群に1例ずつ認められた。

《回復期間終了時》
心臓：雄で心筋への円形細胞浸潤が対照群および1000 mg/kg群に2例ずつ認められた。

肺：雌雄とも気管支周囲への軽度な細胞浸潤が対照群ならびに1000 mg/kg群で認められた。また、肺胞壁内に青い結晶物の沈着が雄の1000 mg/kg群に1例認められた。

肝臓：雌雄とも軽度に単細胞性壊死が対照群および1000 mg/kg群に認められた。

腎臓：雄で近位尿細管にエオジンに好染し、PAS染色で陰性を示す eosinophilic・body・が対照群および1000 mg/kg群で全例に認められた。また、雌では皮髄境界部に石灰沈着が対照群および1000 mg/kg群で3例ずつ認められた。

考察

既存化学物質である銅フタロシアナ−トの28日間反復経口投与毒性試験を5週齢の雌雄Slc:Wistarラットを用いて強制経口投与により行った。投与量は1,000 mg/kgを最高用量として、公比5で200、40 mg/kgおよび溶媒のコーン油を投与する対照群を設けた。また、1,000 mg/kg群と対照群に14日間の回復期間を置く群を設けた。

対照群の1例で投与の過誤によると考えられる死亡例が認められたが、被験物質によると考えられる一般状態、体重、摂餌量の変化はすべての群で認められなかった。

28日間の投与後における血液学的検査で、雄の200と1,000 mg/kg群にRBCの有意な減少とHbおよびPCVの減少傾向が認められ、変化としては非常に小さなものであったが、これらに用量相関性が認められた。また、雌の回復1,000 mg/kg群の僅かな赤芽球の増加および雄の回復1,000 mg/kg群の脾臓の実重量と比重量の増加から、赤血球系への弱い作用が考えられるが、病理組織学的検査で検体によると思われる変化は認められなかった。

雄の回復1,000 mg/kg群で肺、脾臓、精巣、副腎、唾液腺の実重量の増加が認められ、比重量でも僅かな増加の傾向が認められた。

以上の結果から、銅フタロシアナ−トの28日間反復強制経口投与による影響は、200 mg/kg群から認められた軽度の赤血球系への影響のみで、NOELは40 mg/kgと考えられた。

連絡先：
試験責任者黒川雄二
国立衛生試験所安全性生物試験研究センター毒性部
〒158東京都世田谷区上用賀1-18-1
Tel 03-3700-1141Fax 03-3700-2348

Correspondence:
Kurokawa, Yuji
Division of Toxicology, Biological Safety Research Center, National Institute of Health Sciences, Japan
1-18-1 Kamiyoga, Setagaya-ku, Tokyo, 158, Japan
Tel 81-3-3700-1141Fax 81-3-3700-2348