2-ナフトール-3,6-ジスルホン酸ナトリウムの細菌を用いる
復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of Sodium 2-naphthol-3,6-disulfonate on Bacteria

要約

2-ナフトール-3,6-ジスルホン酸ナトリウムの遺伝子突然変異誘発性の有無を検討するため，細菌を用いる復帰突然変異試験を実施した．

試験は，指標菌株としてSalmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAを用い，S9 mix非存在(直接法)および存在(代謝活性化法)下でプレインキュベーション法により行った．

156，313，625，1250，2500および5000 μg/プレート濃度を設定して行った濃度設定試験では，代謝活性化の有無にかかわらず，全ての菌株において生育阻害は認められず，いずれの濃度においても溶媒対照と比較して2倍以上の復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．したがって，本試験は，濃度設定試験と同じ濃度を用いて同様に行った．

試験の結果，濃度設定試験と同様，全ての菌株において代謝活性化の有無にかかわらず，復帰変異コロニー数の増加は認められず，また，菌の生育阻害も認められなかった．

以上の成績から，本実験条件下では，2-ナフトール-3,6-ジスルホン酸ナトリウムは，細菌に対し遺伝子突然変異を誘発しない(陰性)と結論した．

方法

1.　指標菌株

国立公衆衛生院地域環境衛生学部から1994年12月19日に分与を受けたS. typhimurium TA98，TA100，TA1535，TA1537１）およびE. coli WP2 uvrA２）の5菌株を用いた．各菌株は，超低温槽で-80℃以下に凍結保存した．

試験に際して，各凍結菌株を解凍後，その30 μLをニュートリエントブロス(Bacto nutrient broth dehydrated，Difco Laboratories)液体培地15 mLに接種し，37℃で12時間振盪培養した．培養後の菌懸濁液は，濁度を測定し，濁度と生菌数の換算式より1 mLあたり1×109以上の生菌数が得られていることを確認し，試験菌液とした．

各菌株の遺伝的特性検査は，凍結保存菌の調製時並びに各実験ごとに行い，本試験に用いた菌株が規定の特性を保持していることを確認した．

2.　被験物質

2-ナフトール-3,6-ジスルホン酸ナトリウム(ロット番号D-1101，スガイ化学工業提供)は，緑がかった灰色の粉末で，水に可溶，ジメチルスルホキシド(DMSO)，メタノールに不溶であり，分子式C10H6Na2O7S2，分子量348.26，純度96.4％(不純物として，水約3％，無機分0.1％以下，微量の異性体を含む)の物質である．

実験終了後，被験物質提供元において残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．

3.　被験物質供試液の調製

溶媒に蒸留水(大塚製薬工場)を用い，被験物質を溶解して最高濃度の供試液(原液)を調製した．この原液の一部を溶媒で順次希釈して所定濃度の供試液を調製した．供試液は，用時調製した．

4.　陽性対照物質

陽性対照物質として下記のものを使用した．

AF-2:2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(和光純薬工業)
2-AA:2-アミノアントラセン(和光純薬工業)
SA　:アジ化ナトリウム(和光純薬工業)
9-AA:9-アミノアクリジン(Aldrich Chemical Co.)

AF-2および2-AAはDMSO(同仁化学研究所)に，SAおよび9-AAは蒸留水(大塚製薬工場)に溶解した．

5.　培地

1)　最少グルコース寒天平板培地(プレート)

テスメディアAN培地(オリエンタル酵母工業)を購入し，使用した．培地1 Lあたりの組成は下記のとおりであり，径90 mmのシャーレ1枚あたりに30 mLを分注したものである．

硫酸マグネシウム・七水塩0.2 g
クエン酸・一水塩2 g
リン酸水素二カリウム10 g
リン酸一アンモニウム1.92 g
水酸化ナトリウム0.66 g
グルコース20 g
寒天(OXOID Agar No.1)15 g

2)　アミノ酸添加軟寒天培地(トップアガー)

0.6％寒天粉末(Difco Laboratories)および0.5％塩化ナトリウムの組成の軟寒天を調製し，これに，S. typhimurium用には0.5 mM D-ビオチンおよび0.5 mM L-ヒスチジン水溶液，E. coli用には0.5 mM L-トリプトファン水溶液を1/10容加え，トップアガーとした．

6.　S9 mix

製造後6ヶ月以内のエームステスト用凍結S9 mix(キッコーマン)を購入し，使用した．S9は，誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製されたものである．

7.　試験方法

試験は，プレインキュベーション法で行った．

試験管に使用溶媒，被験物質供試液あるいは陽性対照物質溶液を0.1 mL，次いで直接法では0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)を0.5 mL，代謝活性化法ではS9 mixを0.5 mL加え，続いて試験菌液0.1 mLを分注し，37℃で20分間振盪培養した．培養終了後，45℃に保温したトップアガー2 mLを加えた混合液をプレート上に重層した．37℃で48時間培養後，復帰変異コロニーを計数し，同時に指標菌株の生育阻害の有無を実体顕微鏡を用いて観察した．プレートは，各濃度とも3枚を使用した．

8.　結果の判定

結果の判定は，各濃度におけるプレートでの復帰変異コロニー数の平均値を基に，以下の3基準を全て満たす場合を陽性とした．

1)被験物質処理群において溶媒対照値の2倍以上の復帰変異コロニー数が出現する．
2)被験物質濃度の増加とともに復帰変異コロニー数が増加する(濃度依存性)．
3)濃度設定試験および本試験の結果から，復帰変異コロニー数の増加に再現性が認められる．

結果および考察

156〜5000 μg/プレートの範囲で濃度を設定(公比2)して行った濃度設定試験(Table 1，2)では，直接法および代謝活性化法ともに，いずれの指標菌株においても溶媒対照と比較して2倍以上の復帰変異コロニー数の増加は認められず，また，いずれの菌株においても被験物質による生育阻害は認められなかった．したがって，本試験における被験物質の処理濃度は，最高濃度を5000 μg/プレートとし，以下公比2で2500，1250，625，313および156 μg/プレートとした．

本試験の結果(Table 3，4)は，濃度設定試験と同様，直接法および代謝活性化法のいずれの場合も，供試した全ての菌株における復帰変異コロニー数は，溶媒対照値の2倍を越えるものではなかった．また，いずれの菌株においても生育阻害は認められなかった．

以上の成績から，本実験条件下では，2-ナフトール-3,6-ジスルホン酸ナトリウムの遺伝子突然変異誘発性は陰性と判定した．

なお，2-ナフトールの変異原性については，S. typhimuriumを用いた復帰突然変異試験で陰性，DNA修復試験では，Bacillus subtilisを用いた場合は陰性，E. coliを用いた場合は陽性であり，がん原性については陰性と報告されている３）．また，シリアンハムスター由来のBHK21cl13細胞を用いたトランスフォーメーション試験では陰性と報告されている４）．

文献

1)D.M. Maron, B.N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983).
2)M.H.L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures,"1, Vol.3, eds. by B.J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp. 161-187.
3)W. Suter, I. Iaeger, Mutat. Res., 97, 1(1982).
4)賀田恒夫，石館 基 監修，"環境変異原データ集1，"　サイエンティスト社，東京，1980，p. 289.

連絡先
試験責任者：野田　篤
試験担当者：野田　篤，昆　尚美
(財)畜産生物科学安全研究所
〒229-1132　神奈川県相模原市橋本台3-7-11
Tel 042-762-2775Fax 042-762-7979

Correspondence
Authors:Atsushi Noda(Study director)
Naomi Kon
Research Institute for Animal Science in Biochemistry and Toxicology
3-7-11 Hashimotodai, Sagamihara-shi, kanagawa, 229-1132, Japan
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