メチレンジフェノールのチャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験

In Vitro Chromosomal Aberration Test of Methylenediphenol on Cultured Chinese Hamster Cells

要約

メチレンジフェノールの培養細胞に及ぼす細胞遺伝学的影響について，チャイニーズ・ハムスター培養細胞 (CHL/IU)を用いて染色体異常試験を実施した．

連続処理(24時間)および短時間処理(6時間)における50 %細胞増殖抑制濃度は，連続処理では0.057 mg/mL，S9 mix非存在下およびS9 mix存在下における短時間処理ではそれぞれ0.091 mg/mLおよび0.0094 mg/mLであった．従って，各系列での処理濃度は，50 %細胞増殖抑制濃度の約2倍濃度を最高処理濃度とし，公比2で5濃度設定した．連続処理では，24時間処理後，短時間処理ではS9 mix非存在下および存在下で6時間処理し，新鮮培地で更に18時間培養後，標本を作製し，検鏡することにより染色体異常誘発性を検討した．染色体分析が可能な最高濃度は，24時間連続処理では0.060 mg/mL，S9 mix非存在下および存在下での短時間処理では0.090 mg/mLおよび0.0090 mg/mLであったことから，これらの濃度を高濃度群として3濃度群を観察対象とした．

CHL/IU細胞を24時間連続処理した群では，いずれの処理群においても，染色体の構造異常および倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．S9 mix非存在下および存在下の短時間処理では，どちらの系列でも高濃度群 (S9 mix非存在下:0.090 mg/mL，S9 mix存在下:0.0090 mg/mL)において染色体の構造異常が誘発され，その頻度はそれぞれ14.0 %および19.5 %(gapを除く)であった．S9 mix非存在下では，いずれの処理群においても倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．S9 mix存在下の短時間処理では倍数性細胞の誘発に関して有意差(p<0.01)が認められたが，その出現頻度が低いことから，陰性と判定した．

以上の結果より，本試験条件下でメチレンジフェノールは，染色体異常を誘発する(陽性)と結論した．

方法

1.　使用した細胞

リサーチ・リソースバンク(JCRB)から入手(1988年2月，入手時:継代4代，現在21代)したチャイニーズ・ハムスター由来のCHL/IU細胞を，解凍後継代10代以内で試験に用いた．

2.　培養液の調製

培養には，仔牛血清(CS, Cansera International)を10 vol%添加したイーグルMEM(日水製薬(株))培養液を用いた．

3.　培養条件

2 × 104個のCHL/IU細胞を，培養液5 mLを入れたディッシュ(径6 cm, Corning)に播き，37 ℃のCO2インキュベーター(5 % CO2)内で培養した．連続処理では，細胞播種3日目に被験物質を加え，24時間処理した．また，短時間処理では，細胞播種3日目にS9 mix非存在下および存在下で6時間処理し，処理終了後新鮮な培養液でさらに18時間培養した．

4.　S9

S9 (キッコーマン(株))は，フェノバルビタールと5,6-ベンゾフラボンを投与した雄Sprague-Dawley系ラットの肝臓から調製したものを購入した．添加量は培地に対して5 vol%とした．

5.　被験物質

メチレンジフェノール(ロット番号:S980013，三井化学(株)(名古屋))は，10 fストランド状の固体で，水に対しては100 mmol/L未満，DMSOでは2 mol/L以上，アセトンでは50 mg/mL以上で溶解し，融点100 ℃，沸点 360-370 ℃(102 kPa)，蒸気圧402 Pa(200 ℃)で，純度 99.0 %(本品は3種類の異性体，2,4'-ジヒドロキシジフェニルメタン50.0 %，ビス(m-ヒドロキシフェニル)メタン30.2 %，ビス(o-ヒドロキシフェニル)メタン18.8 %の混合物で，不純物はフェノール，ホルムアルデヒド，シュウ酸，蟻酸を含む)の物質で，暗所において冷蔵保存した．被験物質原体は，冷蔵保存下で安定であった．

6.　被験物質の調製

被験物質は用時調製して試験に用いた．溶媒は DMSO(ロット番号:ACL5008，和光純薬工業(株))を用いた．原体を溶媒に溶解して原液を調製し，ついで原液を溶媒で順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を作製した．被験物質調製液は，すべての試験において培養液の0.5 vol%になるように加えた．

7.　細胞増殖抑制試験

染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため，被験物質の細胞増殖に及ぼす影響を調べた．被験物質のCHL/IU細胞に対する増殖抑制作用は，単層培養細胞密度計(MonocellaterTM，オリンパス光学工業(株))を用いて各群の増殖度を計測し，被験物質処理群の溶媒対照群に対する細胞増殖の比をもって指標とした．

その結果，連続処理における50 %細胞増殖抑制濃度は0.057 mg/mL，S9 mix非存在下および存在下における短時間処理では，それぞれ0.091 mg/mLおよび0.0094 mg/mLであった(Fig. 1, 2)．

8.　実験群の設定

細胞増殖抑制試験の結果より，染色体異常試験において，連続処理および短時間処理のすべての処理群で，50 %細胞増殖抑制濃度の約2倍濃度を最高処理濃度とし，公比2で5濃度を設定した(連続処理:0.0075，0.015，0.030，0.060，0.12 mg/mL，S9 mix非存在下での短時間処理:0.011，0.023，0.045，0.090，0.18 mg/mL，S9 mix存在下での短時間処理:0.0011，0.0023，0.0045，0.0090，0.018 mg/mL)．陽性対照物質として用いたマイトマイシンC(MC，協和醗酵工業(株))およびシクロホスファミド(CPA, Sigma Chemical Co.)は，局方注射用水((株)大塚製薬工場)に溶解して調製した．それぞれ染色体異常を誘発することが知られている濃度を適用した．

染色体異常試験においては1濃度あたり4枚のディッシュを用い，そのうちの2枚は染色体標本を作製し，別の2枚については単層培養細胞密度計により細胞増殖率を測定した．

9.　染色体標本作製法

培養終了の2時間前に，コルセミドを最終濃度が約0.1 μg/mLになるように培養液に加えた．染色体標本の作製は常法に従って行った．スライド標本は各ディッシュにつき6枚作製した．作製した標本を3 vol%ギムザ溶液で染色した．

10.　染色体分析

細胞増殖率測定の結果と分裂指数により，20 %以上の相対増殖率で，かつ2ディッシュともに0.5 %以上の分裂指数を示した最も高い濃度を観察対象の最高濃度群とし，観察対象の3濃度群を決定した．その結果(Table 1, 2)，連続処理では0.060 mg/mLが，S9 mix非存在下およびS9 mix存在下での短時間処理では0.090 mg/mLおよび0.0090 mg/mLが染色体分析の可能な最高濃度であったことから，これらの濃度を含む3濃度群を観察対象とした．

作製したスライド標本のうち，1つのディッシュから得られた異なるスライドを，4名の観察者がそれぞれ処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した．染色体の分析は，日本環境変異原学会・哺乳動物試験研究会(MMS)1)による分類法に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型のギャップ，切断，交換などの構造異常の有無と倍数性細胞(polyploid)の有無について観察した．また構造異常については1群200個，倍数性細胞については1群800個の分裂中期細胞を分析した．

11.　記録と判定

無処理対照，溶媒および陽性対照群と被験物質処理群についての分析結果は，観察した細胞数，構造異常の種類と数，倍数性細胞の数について集計し，各群の値を記録用紙に記入した．

染色体異常を有する細胞の出現頻度について，溶媒対照群と被験物質処理群および陽性対照群間でフィッシャーの直接確率法2)により，有意差検定を実施した (p<0.01)．また，用量依存性に関してコクラン・アーミテッジの傾向性検定3) (p<0.01)を行った．これらの検定結果を参考とし，生物学的な観点からの判断を加味して染色体異常誘発性の評価を行った．

結果および考察

連続処理による染色体分析の結果をTable 1に示した．メチレンジフェノールを加えて24時間連続処理したいずれの処理群においても，染色体の構造異常および倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．

短時間処理による染色体分析の結果をTable 2に示した．メチレンジフェノールを加え，S9 mix非存在下で6時間処理した群では，高濃度群(0.090 mg/mL)において染色体の構造異常が誘発され，その頻度は14.0 %(gapを除く)であった．一方，いずれの処理群においても有意な倍数性細胞の増加は認められなかった．S9 mix存在下で6時間処理した場合は，高濃度群(0.0090 mg/mL)で有意な染色体の構造異常の増加が認められ，その頻度は19.5 %(gapを除く)であった．また，高濃度群(0.0090 mg/mL)で倍数性細胞の出現頻度に有意差が認められ，傾向性検定(p<0.01)でも有意差が認められたが，その出現頻度が1.50 %と低いことから，陰性と判定した．

従って，メチレンジフェノールは，上記の試験条件下で，試験管内のCHL/IU細胞に染色体異常を誘発すると結論した．

メチレンジフェノールの関連物質としては，様々なビスフェノール類があげられる．ビスフェノールAについては，復帰変異試験で陰性の結果が報告されている4)が，分裂装置である紡錘糸の形成を阻害し，異数性細胞(染色体の数的異常)を誘発することが，CREST染色法(キネトコア抗体を用いる動原体の蛍光抗体染色法)を用いた小核の分析結果から示唆されている5)．本試験で使用した被験物質中には，異性体としてビス(p-ヒドロキシフェニル)メタン(異性体の混合比率:30.2 %)を含んでおり，この物質については異数性細胞を誘発しないことが報告されている5)．本試験では異数性細胞誘発の指標となる倍数細胞の誘発は認められなかったが，構造異常が増加したことから，他の2種類の異性体によって構造異常が誘発された可能性が考えられる．また，ホルマリン(37 %ホルムアルデヒド溶液)は，0.015 mg/mL以上の濃度でCHL/IU細胞に染色体異常を誘発することが報告されている6)．しかしながら，被験物質におけるホルムアルデヒド含有量は1 %未満であり，今回誘発された染色体異常は被験物質中のホルムアルデヒドに起因しないものと考えられる．

文献

1)日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編，“化学物質による染色体異常アトラス，”朝倉書店，東京，1988, pp. 16-37.
2)吉村功編，“毒性・薬効データの統計解析，事例研究によるアプローチ，”サイエンティスト社，東京，1987, pp. 76-78.
3)吉村功，大橋靖夫編，“毒性試験講座14，毒性試験データの統計解析，”地人書館，東京，1992, pp. 218-223.
4)労働省労働基準局安全衛生部化学物質調査課監修，“労働安全衛生法有害性調査制度に基づく既存化学物質変異原性試験データ集，”日本化学物質安全・情報センター編集・発行，東京，1996.
5)E. Pfeiffer et al., Mutat. Res., 390, 21(1997).
6)石舘基監修，“改訂増補染色体異常試験データ集，”エル・アイ・シー，東京，1987, p.197.

連絡先
試験責任者：日下部博一
試験担当者：田中憲穂，山影康次，高橋俊孝，若栗　忍，橋本恵子
(財)食品薬品安全センター秦野研究所
〒257-8523　神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751　Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Hirokazu Kusakabe(Study director) Noriho Tanaka, Kohji Yamakage, Toshitaka Takahashi, Shinobu Wakuri, Keiko Hashimoto
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano, Kanagawa, 257-8523, Japan
Tel +81-463-82-4751　Fax +81-463-82-9627