)を入れたプラスチック製ケージに個別に移し，自然分娩および哺育をさせた．飼料は固型飼料(CRF-1，オリエンタル酵母工業)を，飲料水は水道水をいずれも自由に摂取させた．なお，剖検前日の午後4時からは絶食とした．
雌においては，一般状態では1000 mg/kg群で表皮温下降，自発運動の低下，脱毛，被毛の汚れおよび腟口からの出血がみられ，死亡例と瀕死例が各1例認められた．体重は，300 mg/kg群で妊娠期に増加抑制が，1000 mg/kg群で交配前，妊娠期および哺育期に増加抑制がみられた．摂餌量は，300 mg/kg群で哺育期に低値が，1000 mg/kg群で交配前，妊娠期および哺育期に低値あるいはその傾向がみられた．剖検所見では，1000 mg/kg群で胸腺の萎縮がみられた．器官重量では，300 mg/kg群で腎臓の相対重量の高値が，1000 mg/kg群で胸腺の絶対重量および相対重量の低値，脾臓の絶対重量の低値および相対重量の低値傾向，肝臓，腎臓および副腎の相対重量の高値がみられた．病理組織学検査では，1000 mg/kg群で胸腺の皮質および髄質の萎縮，脾臓の辺縁帯の萎縮，腎臓の皮髄境界部尿細管の変性・壊死がみられた．
以上のように，ジビニルベンゼンの一般毒性学的無影響量は，雄では100 mg/kg投与により肝臓の相対重量の高値が認められたことから30 mg/kg/day，雌では300 mg/kg投与により体重の増加抑制，摂餌量の低値が認められたことから100 mg/kg/dayと考えられる．また，生殖発生毒性学的な無影響量は，雄では交尾および受胎能に影響が認められなかったことから1000 mg/kg/day，雌では1000 mg/kg投与により哺育行動の異常，黄体数および着床痕数の低値が認められたことから300 mg/kg/day，児動物の発生では100 mg/kg投与により体重の低値が認められたことから30 mg/kg/dayと考えられる．
，純度:96.2 ％，ただし，不純物としてエチルビニルベンゼンを3.2 wt％，p-tert-ブチルカテコールを 1010 ppm，その他を0.6 wt％含有)．入手後は，冷蔵・遮光条件下で保管した．なお，投与期間終了後に被験物質の一部を製造元に送付して分析した結果，使用期間中の安定性が確認された．被験物質は，コーンオイルに希釈して調製した．なお，2，20および200 mg/mLの調製液は，調製後冷蔵・遮光条件下で7日間，さらに室温・遮光条件下で4時間保存しても安定性に問題のないことが確認されていたため，各濃度の調製液は調製後，冷蔵・遮光条件下で保管し，調製後7日以内に使用した．被験物質は純度による換算を行って調製した．
から購入した．入手した動物は，5日間の検疫期間およびその後7日間の馴化期間を設け，一般状態および体重推移に異常がみられず，また性周期観察で異常が認められなかった動物を群分けして試験に用いた．群分けは，コンピュータを用いて体重を層別に分けた後に，無作為抽出法により各群の平均体重および分散がほぼ等しくなるように投与開始日に行った．1 群の動物数は，雌雄各12匹とした．
動物は，室温20〜24℃，湿度40〜70 ％，明暗各12時間(照明:午前6時〜午後6時)，換気回数12回／時に設定した飼育室で飼育した．検疫・馴化期間中はステンレス製ケージを用いて1ケージあたり5匹までの群飼育とし，群分け後はステンレス製ケージを用いて個別飼育した．また，母動物は，妊娠18日にオートクレーブ処理した床敷(サンフレーク，日本チャールス・リバー)を入れたプラスチック製ケージに個別に移し，自然分娩および哺育をさせた．飼料は固型飼料(CRF-1，オリエンタル酵母工業)を，飲料水は水道水をいずれも自由に摂取させた．なお，剖検前日の午後4時からは絶食とした．
投与量は，先に実施した雄ラットを用いた2週間経口投与による予備試験(投与段階:0，125，250，500および1000 mg/kg，各群5例)の結果により決定した．すなわち，125 mg/kg以上の群で投与直後に流涎が，1000 mg/kg群で体重および摂餌量の低値がみられたが，各群とも死亡発現は認められなかった．そこで，当試験の投与量は，1000 mg/kgを最高用量とし，以下公比約3で 300，100および30 mg/kgとした．また，対照として被験物質投与群の投与液と同一容量の媒体(コーンオイル)のみを投与する群を設けた．
赤血球数(RBC)，ヘモグロビン量，ヘマトクリット値，血小板数および白血球数(WBC)は，EDTA-2KコーティングしたSysmexサンプルカップに採取した血液について，多項目自動血球計数装置(Sysmex K-4500，東亜医用電子)を用いて測定した．さらに，平均赤血球容積(MCV)，平均赤血球血色素量(MCH)および平均赤血球血色素濃度(MCHC)を算出した．
網状赤血球数(RET)は，EDTA-2K処理した血液をBrecher法により超生体染色してスライドグラスに塗抹後，Giemsa染色した標本を作製して顕微鏡下で赤血球 1000 個中の数を計数した．
白血球百分率は，EDTA-2K処理した血液をスライドグラスに塗抹し，May-Giemsa染色した標本を作製して顕微鏡下で白血球 100 個を分類計数した．
プロトロンビン時間(PT)，活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)およびフィブリノーゲン濃度は，3.13 ％クエン酸ナトリウムで処理した血漿について，散乱光検出方式により血液凝固分析装置(コアグマスター
，三共)を用いて測定した．
GOTおよびGPTはHenry変法，ALPはρ-NPP基質法，γ-GTPはγ-G-P-NA基質法，総蛋白はBiuret法，総ビリルビンはAzobilirubin法，尿素窒素(BUN)はUrease・GlDH法，クレアチニンはJaff
法，ブドウ糖はGlucose dehydrogenase法，総コレステロールはCOD・DAOS法，トリグリセライドはGPO・DAOS法，Caはο-CPC法，無機リンはMolybdenum blue法により，自動分析装置(AU 500，オリンパス光学工業)を用いて測定した．
NaおよびKはイオン選択電極法により，Clは電量滴定法により，いずれも全自動電解質分析装置(EA04，A & T)を用いて測定した．
蛋白分画は，電気泳動法により自動電気泳動装置(AES 600，オリンパス光学工業)を用いて測定した．
アルブミン量は総蛋白量および蛋白分画値から，A/G比は蛋白分画値から算出した．
交尾確認は毎朝ほぼ一定時刻に行い，腟垢内に精子または腟栓を確認した雌を交尾成立動物として，その日を妊娠0日として起算した．
体重(親動物，新生児)，摂餌量，発情回数，交尾所要日数，妊娠期間［分娩日(哺育0日)-交尾確認日］，着床痕数，総出産児数(新生児数＋死産児数)，新生児数，分娩率［(総出産児数／着床痕数)×100］，児の産出率［(哺育0日の新生児数／着床痕数)×100］，黄体数，着床率［(着床痕数／黄体数)×100］，出生率［(哺育0日の新生児数／総出産児数)×100］，哺育4日の新生児数，哺育4日の生存率［(哺育4日の新生児数／哺育0日の新生児数)×100］，外表異常出現率［(外表異常児数／新生児数)×100］，性比(雄／雌)，器官重量(相対重量を含む)，血液学検査成績，血液生化学検査成績については，各群で平均値および標準偏差を算出した．有意差検定は，Bartlett法による等分散性の検定を行い，等分散ならば一元配置法による分散分析を行い，有意ならばDunnett法を用いて行った．一方，等分散と認められなかった場合は，順位を利用した一元配置法による分析(Kruskal-Wallisの検定)を行い，有意ならば順位を利用したDunnett型の検定法を用いて行った．
交尾率［(交尾成立動物数／同居動物数)×100］，受胎率［(受胎雌数／交尾成立動物数)×100］，出産率［(新生児出産雌数／受胎雌数)×100］は，c 2検定を用いた．
なお，病理組織学検査において，1000 mg/kg群で毒性学的影響が示唆され他の用量群についても検査を実施した器官・組織の所見については，上記の順位を利用したDunnett型の検定法を用いて行った．そこで有意差が認められた所見については，Cochran・Armitageの傾向検定を用いて用量反応性の検定を実施した．
一般状態観察において，対照群では，観察期間を通していずれの動物にも異常はみられなかった．30 mg/kg以上の群では，流涎が投与後にみられた．1000 mg/kg群では，さらに表皮温下降および脱毛が1例に，被毛の汚れが1〜8例にみられた．流涎は，各群とも投与後約 30分までの間に観察され，投与を継続しても流涎の持続時間に変化はみられなかった．なお，100 mg/kg群で切歯の破損がみられたが，1例のみであり偶発例と判断した．
その他には，心臓，肺，気管，膵臓，胃，十二指腸，空腸，回腸，盲腸，結腸，直腸，胸腺，脾臓，リンパ節(下顎・腸間膜)，腎臓，副腎，膀胱，前立腺，精嚢，下垂体，甲状腺，上皮小体，脳(大脳・小脳・延髄)，脊髄，坐骨神経および骨髄(胸骨・大腿骨)では対照群および 1000 mg/kg群とも異常はみられなかった．
1000 mg/kg群では，妊娠17日に1例が死亡し，妊娠23日に1例が分娩中に瀕死状態となった．死亡例では，流涎，脱毛，表皮温下降，自発運動の低下，腟口からの出血が認められた．瀕死例では，流涎，表皮温下降，自発運動の低下が認められた．
生存例の一般状態観察において，対照群および30 mg/kg群では観察期間を通していずれの動物にも異常はみられなかった．100 mg/kg以上の群で流涎が投与後にみられた．1000 mg/kg群では，さらに脱毛が1例に，被毛の汚れが1〜2例にみられた．
妊娠期間中では，30および100 mg/kg群の体重は対照群とほぼ同様の推移であり，いずれの測定日にも有意差はみられなかった．300 mg/kg群では，対照群と比べて妊娠7および14日に体重の有意な低値がみられた．1000 mg/kg群では，対照群と比べて妊娠0〜21日に体重の有意な低値がみられた．
哺育期間中では，30，100および300 mg/kg群の体重は対照群とほぼ同様の推移であり，いずれの測定日にも有意差はみられなかった．1000 mg/kg群では，対照群と比べて哺育0および4日に体重の有意な低値がみられた．
妊娠期間中では，30，100および300 mg/kg群の摂餌量は対照群とほぼ同様の推移であり，いずれの測定日にも有意差はみられなかった．1000 mg/kg群では，対照群と比べて妊娠21日に摂餌量の有意な低値がみられた．
哺育期間中では，30および100 mg/kg群の摂餌量は対照群と比べて有意差はみられなかった．300 mg/kg群では，対照群と比べて哺育4日に摂餌量の有意な低値がみられた．
1000 mg/kg群では，対照群と比べて有意差は認められなかったが，哺育4日に摂餌量の低値傾向がみられた．
1000 mg/kg群の死亡例の剖検において，胸腺の萎縮がみられた．
1000 mg/kg群の瀕死例の剖検において，胸腺の萎縮と腺胃粘膜の暗赤色斑がみられた．
その他には，心臓，肺，気管，膵臓，十二指腸，空腸，回腸，盲腸，結腸，直腸，リンパ節(下顎・腸間膜)，副腎，膀胱，卵巣，子宮，腟，下垂体，甲状腺，上皮小体，脳(大脳・小脳・延髄)，脊髄，坐骨神経，骨髄(胸骨・大腿骨)および乳腺では対照群および1000 mg/kg群とも異常はみられなかった．
1000 mg/kg投与群の死亡例において，胸腺の皮質および髄質の萎縮が中等度に，脾臓の辺縁帯の萎縮が軽度にみられた．
1000 mg/kg投与群の瀕死例において，肝臓の小葉中心性壊死が軽度に，膵臓の腺房細胞のチモーゲン顆粒減少が中等度に，腺胃粘膜のびらんが軽度に，胸腺の皮質および髄質の萎縮が中等度に，赤脾髄の萎縮がごく軽度に，腎臓の皮髄境界部尿細管の変性・壊死が中等度に，骨髄の造血の低下が軽度にみられた．
対照群の1組を除いた全例で交尾が確認された．交尾所要日数は，各投与群とも対照群との間に有意差はみられなかった．また，交尾率にも，各投与群と対照群との間に有意差はみられなかった．不受胎雌は，1000 mg/kg投与群で1例みられたが，受胎率には各投与群と対照群との間に有意差はみられなかった．新生児が得られなかった受胎雌は，1000 mg/kg群の死亡例および瀕死例を除くと30 mg/kg群の1例のみであった．
30，100および300 mg/kg群では，対照群と比べて黄体数，着床痕数および着床率に有意差はみられなかった．1000 mg/kg群では，対照群と比べて黄体数および着床痕数の有意な低値がみられた．
対照群，100，300および1000 mg/kg群では出産率は 100 ％であった．30 mg/kg群では，1例で新生児が得られなかったため出産率は91.7 ％となったが，投与に基づくものではないと判断した．対照群，30，100および300 mg/kg群では，哺育状態に異常はみられなかった．1000 mg/kg群では，哺育0日あるいは哺育1日から乳腺の発育不良および巣作り不良を示した母動物が3例みられ，新生児が全例死亡した母動物が7例認められた．
30，100および300 mg/kg群では，対照群と比べて哺育0日の新生児数，出生率および性比に有意差はみられなかった．30および100 mg/kg群では，対照群と比べて児の産出率に有意差はみられなかった．なお，300 mg/kg群では，対照群と比べて児の産出率の有意な高値がみられたが，投与量に依存した変化ではなかった．1000 mg/kg群では，対照群と比べて哺育0日の新生児数および出生率の有意な低値，有意差はないが児の産出率の低値傾向がみられた．
30，100 および300 mg/kg群では，対照群と比べて哺育4日の生存児数，哺育4日の生存率および性比に有意差はみられなかった．1000 mg/kg群では，対照群と比べて哺育4日の生存児数および哺育4日の生存率の有意な低値がみられた．
新生児の外表観察では，無尾が30 mg/kg群で1例に，尾の壊死が100 mg/kg群で1例にみられたが，いずれも偶発例と判断した．
新生児の一般状態では，30 mg/kg群で尾の外傷，尾の欠落および表皮温下降が各1例にみられたが，いずれも偶発例と判断した．1000 mg/kg群では，表皮温下降が4腹(うち3腹は乳腺の発育不良および巣作り不良が認められた母動物)に，尾の外傷が1例にみられた．
雄動物に関しては，死亡および瀕死例はいずれの群にもみられなかった．一般状態観察において，1000 mg/kg群では表皮温下降，脱毛および被毛の汚れがみられた．また，1000 mg/kg群では，体重の増加抑制および摂餌量の低値がみられ，全身状態の悪化を来すと考えられる．300 mg/kg群でも，体重の増加抑制がみられたが，一過性の軽度な変化であった．なお，30 mg/kg以上の群で投与後に一過性の流涎がみられたが，ジビニルベンゼンの刺激性に基づく変化と判断され，毒性症状とはみなさなかった．また，100 mg/kg以上の群で投与期間の中期以降に認められた摂餌量の高値は，毒性学的には意義のない変化と判断される．
血液学検査においては，1000 mg/kg群でも各検査項目に異常は認められなかった．
血液生化学検査において，300 mg/kg群でβ -グロブリン率の高値が，1000 mg/kg群でGPT，γ-GTP，α2-グロブリン率，β -グロブリン率および総ビリルビンの高値，アルブミン量，α1-グロブリン率，α3-グロブリン率および血糖の低値がみられた．また，100 mg/kg以上の群で肝臓の相対重量の高値が認められたが，病理組織学検査では肝臓に変化は認められていないことから毒性学的に重篤なものではないと判断される．300 mg/kg以上の群で腎臓の絶対重量および相対重量の高値あるいはその傾向がみられたが，腎臓への影響を示唆する血液生化学検査成績に変化は認められないこと，病理組織学検査では腎臓に変化は認められないことから毒性学的に重篤なものではないと判断される．
剖検および病理組織学検査では，投与に起因すると考えられる変化はみられなかった．
雌動物に関しては，1000 mg/kg群で死亡例が1例と瀕死例が1例認められた．死亡例では，急激な体重減少，表皮温下降，自発運動の低下，脱毛および腟口からの出血がみられ，剖検において胸腺の萎縮が認められた．瀕死例でも，表皮温下降および自発運動の低下がみられ，剖検において胸腺の萎縮と腺胃粘膜の暗赤色斑が認められた．死亡例の病理組織学的検査において胸腺の皮質および髄質の萎縮ならびに脾臓の辺縁帯の萎縮が，瀕死例においても肝臓の小葉中心性壊死，膵臓の腺房細胞のチモーゲン顆粒減少，腺胃粘膜のびらん，胸腺の皮質および髄質の萎縮，赤脾髄の萎縮，腎臓の皮髄境界部尿細管の変性・壊死ならびに骨髄の造血低下がみられた．すなわち，死亡例では，生存例と同様に胸腺の萎縮，脾臓の辺縁帯の萎縮が認められているが，死因となるほどの変化ではないことから，直接の死因は不明である．また，瀕死例では，胸腺の萎縮，尿細管の変性・壊死，肝臓の小葉中心性の壊死，骨髄の造血低下がみられていることことから，胸腺，脾臓の変化を主として腎臓，肝臓，骨髄に変化が生じ，さらに全身状態の悪化を招来したことにより瀕死状態になったと推定される．
一般状態観察においては，生存例でも脱毛および被毛の汚れがみられた．なお，雄の場合と同様に100 mg/kg以上の群で流涎がみられた．1000 mg/kg群では，雄と同様に体重の増加抑制および摂餌量の低値あるいはその傾向が交配前投与期間，妊娠期間および哺育期間にみられた．また，300 mg/kg群でも妊娠期間に体重の増加抑制，哺育期に摂餌量の低値がみられた．器官重量では，300 mg/kg以上の群で腎臓の相対重量の高値，1000 mg/kg群で胸腺の絶対重量および相対重量の低値，肝臓の相対重量の高値，脾臓の絶対重量および相対重量の低値あるいはその傾向，副腎の相対重量の高値がみられた．病理組織学的検査において，1000 mg/kg群で胸腺の皮質および髄質の萎縮，脾臓の辺縁帯の萎縮，腎臓の皮髄境界部尿細管の変性・壊死がみられ，1000 mg/kg投与で雌では胸腺，肝臓，脾臓および腎臓への影響が生じると考えられる．なお，100 mg/kg群で1例と1000 mg/kg群で2例に観察された前胃の潰瘍は，哺育母動物でしばしば認められることから，ジビニルベンゼンの投与に基づく変化ではないと考えられる．
したがって，当試験条件下におけるジビニルベンゼンの一般毒性学的無影響量は，雄が30 mg/kg/day，雌が 100 mg/kg/dayと考えられる．
親動物の生殖発生に対しては，各投与群とも発情回数，交尾率，交尾所要日数，受胎率，受胎雌数および出産率に影響はみられなかった．また，各投与群とも妊娠期間および分娩状態に影響はみられなかった．しかし，1000 mg/kg群では，乳腺の発育不良と巣作り不良，新生児が全例死亡した母動物が多くみられ，黄体数および着床痕数の低値が認められた．なお，着床痕数の低値は黄体数の低値に伴う変化と考えられる．
新生児に対しては，30 mg/kg群では総出産児数，分娩率，哺育0日の新生児数，出生率，児の産出率，性比，一般状態，哺育4日の生存児数，生存率，体重，剖検にも影響はみられなかった．100および300 mg/kg群では，哺育0日の雌雄の体重の有意な低値がみられた．1000 mg/kg群では，総出産児数の低値，分娩率の低値傾向，哺育0日の新生児数および出生率の低値，児の産出率の低値傾向，哺育4日の生存児数および生存率の低値，表皮温下降，哺育0日および哺育4日の雌雄の体重の低値あるいはその傾向がみられた．1000 mg/kg群の母動物では，脱毛，被毛の汚れを特徴とした一般状態の変化，体重の増加抑制，摂餌量の低値がみられていることから，母動物の全身状態の悪化により，生存率の低下など，分娩および哺育状態に影響を生じたものと考えられる．外表観察では，各投与群ともジビニルベンゼン投与に基づくと考えられる異常はみられなかった．
したがって，当試験条件下におけるジビニルベンゼンの生殖発生毒性学的な無影響量は，雄の生殖に関しては 1000 mg/kg/day，雌の生殖に関しては300 mg/kg/day，児動物の発生に関しては30 mg/kg/dayと推察される．
以上のように，ジビニルベンゼンの一般毒性学的無影響量は，雄では100 mg/kg投与により肝臓の相対重量の高値が認められたことから30 mg/kg/day，雌では300 mg/kg投与により体重の増加抑制，摂餌量の低値が認められたことから100 mg/kg/dayと考えられる．また，生殖発生毒性学的な無影響量は，雄では交尾および受胎能に影響が認められなかったことから1000 mg/kg/day，雌では1000 mg/kg投与により哺育行動の異常，黄体数および着床痕数の低値が認められたことから300 mg/kg/day，児動物の発生では100 mg/kg投与により体重の低値が認められたことから30 mg/kg/dayと考えられる．
| 連絡先 | |||
| 試験責任者： | 古橋忠和 | ||
| 試験担当者： | 長瀬孝彦，藤村高志，内藤一嘉，牧野浩平， 渡邊ゆかり，木村 均 | ||
| 日本バイオリサーチセンター 羽島研究所 | |||
| 〒 501-6251 岐阜県羽島市福寿町間島6-104 | |||
| Tel 058-392-6222 | Fax 058-392-1284 | ||
| Correspondence | ||||
| Authors: | Tadakazu Furuhashi(Study director) Takahiko Nagase, Takashi Fujimura, Kazuyoshi Naitou, Kohei Makino, Yukari Watanabe and Hitoshi Kimura | |||
| Nihon Bioresearch Inc. Hashima Laboratory | ||||
| 6-104, Majima, Fukuju-cho, Hashima, Gifu, 501-6251, Japan | ||||
| Tel +81-58-392-6222 | Fax +81-58-392-1284 | |||