4-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸ナトリウムの
チャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験

In Vitro Chromosomal Aberration Test of
Sodium 4-amino-1-naphthalenesulfonate on Cultured Chinese Hamster Cells

要約

4-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸ナトリウムの培養細胞に及ぼす細胞遺伝学的影響について，チャイニーズ・ハムスター培養細胞(CHL/IU)を用いて染色体異常試験を実施した．

細胞増殖抑制試験の結果をもとに，連続処理法および短時間処理法のいずれにおいても5000 μg/mLを最高濃度とし，それぞれ公比2で3用量を設定した．

CHL/IU細胞を24時間および48時間連続処理した結果，48時間処理の5000 μg/mLで，染色体構造異常細胞の出現頻度は6.5 %であった．このため，48時間処理について，同濃度で確認試験を実施した．その結果，構造異常細胞の出現頻度は5 %未満となり，再現性は認められなかった．なお，連続処理法のいずれの処理群においても，倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．また，短時間処理法のS9 mix存在下および非存在下のいずれの処理群においても，染色体の構造異常や倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．

以上の結果より，4-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸ナトリウムは，染色体異常を誘発しない(陰性)と結論した．

方法

1.　使用した細胞

大日本製薬から入手(1996年11月，入手時:継代14代，凍結時:17代)したチャイニーズ・ハムスター由来のCHL/IU細胞を，解凍後継代5代以内で試験に用いた．

2.　培養液の調製

培養には，非働化した仔牛血清(CS:GIBCO BRL，ロット番号:35K7844)を10 %添加したイーグルMEM(日水製薬)培養液を用いた．

3.　培養条件

2×10^4個のCHL/IU細胞を，培養液5 mLを入れたディッシュ(径6 cm, Becton Dickinson and Company)に播き，37℃のCO2インキュベーター(5 % CO2)内で培養した．

連続処理法では，細胞播種3日目に被験物質を加え，24時間および48時間処理した．また，短時間処理法では，細胞播種3日目にS9 mixの存在下および非存在下で6時間処理し，処理終了後新鮮な培養液でさらに18時間培養した．

4.　被験物質

4-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸ナトリウム(ロット番号:6622，スガイ化学工業提供)は，分子式C10H8NNaO3S，分子量245.24(無水)，純度:76.1 %(不純物(概略値)としてα-ナフチルアミン約50 ppm，β-ナフチルアミン10〜20 ppm，1-アミノナフタレン-5-スルホン酸約0.1 %，2-アミノナフタレン-6-スルホン酸約0.1〜0.2 %を含む)の粉末である．通常の取り扱い条件では安定である．なお，本ロットの安定性は，実験開始前および実験終了後に被験物質供給者が分析し，確認した．

5.　被験物質溶液の調製

被験物質調製液は，用時調製した．溶媒は局方生理食塩液(生食，大塚製薬工場，ロット番号:K6F82)を用いた．原体を溶媒に溶解して原液を調製し，ついで原液を溶媒で順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を作製した．被験物質調製液は，すべての試験において培養液の 10(v/v)%になるように加えた．なお，被験物質秤量の際は，純度換算を実施した．

6.　細胞増殖抑制試験による処理濃度の決定

染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため，被験物質の細胞増殖に及ぼす影響を調べた．被験物質のCHL/IU細胞に対する増殖抑制作用は，単層培養細胞密度計(Monocellator TM，オリンパス光学工業)を用いて各群の増殖度を測定し，被験物質処理群の陰性対照群に対する細胞増殖の比をもって指標とした．

その結果，連続処理法および短時間処理法のいずれにおいても5000 μg/mLまで50 %の細胞増殖を抑制しなかった(Fig.1)．

7.　実験群の設定

細胞増殖抑制試験の結果をもとに，染色体異常試験は連続処理法および短時間処理法のいずれの処理条件においても5000 μg/mLを最高濃度とし，それぞれ公比2で3用量を設定した．

陽性対照として，連続処理法は，マイトマイシンC(MMC，協和発酵工業，ロット番号:119AFG)を0.03 μg/mL，短時間処理法は，ベンゾ〔a〕ピレン(BP，東京化成工業，ロット番号:AX01)を20 μg/mLを設定した．

8.　染色体標本作製法

培養終了の2時間前に，コルセミドを最終濃度が約0.1 μg/mLになるように培養液に加えた．染色体標本の作製は常法に従って行った．スライド標本は各ディッシュにつき2枚作製した．作製した標本を，3 %ギムザ溶液で20分間染色した．

9.　染色体分析

作製したスライド標本のうち，1枚のディッシュから得られたスライドを処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した．染色体の分析は，日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会(MMS)１）による分類法に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型のギャップ，切断，交換などの構造異常の有無と倍数性細胞(polyploid)の有無について観察した．また，構造異常および倍数性細胞については1群200個の分裂中期細胞を分析した．

10.　記録と測定

溶媒および陽性対照群と被験物質処理群についての分析結果は，観察した細胞数，構造異常の種類と数，倍数性細胞の数について集計し，各群の値を記録用紙に記入した．構造異常は，ギャップを持つ細胞を含めた場合(+gap)と含めない場合(-gap)とに区別して集計した．被験物質の染色体異常誘発性についての判定は，石館ら２）の判定基準に従い，染色体異常を有する細胞の頻度が5 %未満を陰性(-)，5 %以上10 %未満を疑陽性(±)，10 %以上を陽性(+)とした．

結果および考察

連続処理法による染色体分析の結果をTable 1，3に示した．4-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸ナトリウムを加えて24時間および48時間連続処理した結果，48時間処理の5000 μg/mLで，染色体構造異常細胞の出現頻度は6.5 %であった．このため，48時間処理について，同濃度で確認試験を実施した．その結果，構造異常細胞の出現頻度は5 %未満となり，再現性は認められず構造異常誘発作用は認められないと判断した．なお，連続処理法のいずれの処理群においても，倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．一方，陽性対照物質のMMCで処理した細胞は，染色体構造異常の顕著な誘発が認められた．

短時間処理法による染色体分析の結果をTable 2に示した．4-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸ナトリウムを加えてS9 mix存在下および非存在下で6時間処理した結果，いずれの処理群においても，染色体の構造異常および倍数性細胞の出現頻度は5 %未満であった．一方，陽性対照物質のBPで処理した細胞は，S9 mix存在下でのみ染色体構造異常の顕著な誘発が認められた．

従って，上記の試験条件下で，4-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸ナトリウムは，染色体異常を誘発しない(陰性)と結論した．

なお，類似化合物である1-アミノナフタレン(CAS No.:134-32-7)の短時間処理法のS9 mix存在下および2-アミノ-5-ヒドロキシ-7-ナフタレンスルホン酸(CAS No.:87-02-5)の短時間処理法のS9 mix存在下の染色体異常試験は陽性と報告されている２, ３）．さらに，ナフタレン(CAS No.:91-20-3)の短時間処理法のS9 mix存在下の染色体異常試験は，構造異常誘発作用は陽性，倍数性細胞誘発作用は疑陽性と報告されている２）．

文献

1)日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編，"化学物質による染色体異常アトラス，"朝倉書店，　1988．
2)石館　基　監修，"〈改訂増補〉染色体異常試験データ集，"エル・アイ・シー社，1987．
3)労働省安全衛生部化学物質調査課　監修，"労働安全衛生法，有害物質調査制度に基づく既存化学物質変異原性試験データ集，"(社)日本化学物質安全・情報センター，1996．

連絡先
試験責任者：太田絵律奈
試験担当者：中川宗洋，石毛裕子，穴澤由美子
三菱化学安全科学研究所　鹿島研究所
〒314-0255　茨城県鹿島郡波崎町砂山14
Tel 0479-46-2871Fax 0479-46-2874

Correspondence
Authors:Erina Ohta(Study director)
Munehiro Nakagawa, Yuko Ishige,
Yumiko Anazawa
Mitsubishi Chemical Safety Institute Ltd., Kashima Laboratory
14 Sunayama, Hasaki-machi, Kashima-gun, Ibaraki, 314-0255, Japan
Tel +81-479-46-2871Fax +81-479-46-2874