テトラヒドロチオフェン-1,1-ジオキシドの
ラットを用いる 28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of
Tetrahydrothiophene 1,1-dioxide in Rats

要約

工業的に溶媒として広く用いられている既存化学物質テトラヒドロチオフェン -1,1-ジオキシドの28日間反復経口投与毒性試験を，SD系[Crj:CD(SD)]ラットを用い，0(対照)，60，200および700 mg/kg/day用量の投与により実施した．動物数は1群雌雄各6匹とし，6群を設け，4群はそれぞれ0，60，200および700 mg/kg/dayを投与し，投与期間終了時に屠殺した．2群は0(対照)および700 mg/kgの14日間回復群とした．

一過性の自発運動低下が，投与初期に 700 mg/kg群の雌に認められた．体重増加の抑制および摂餌量の減少が，700 mg/kg群の雌雄に認められた．尿および血液学検査では，被験物質の投与に起因すると考えられる変化は認められなかった．血液生化学検査では，700 mg/kg群の雄に有意なコリンエステラーゼおよび総ビリルビンの増加，塩素の減少が，また雌にGPTの増加，グルコースの減少が認められた．病理学検査では，腎臓の近位尿細管上皮における硝子滴および好酸体の増加が200および700 mg/kg群の雄に認められ，700 mg/kg群の雄の腎臓相対重量は有意に増加した．700 mg/kg群の雌で，脾臓の絶対重量の有意な減少が認められたが，組織学的には異常は認められなかった．回復群においては，腎臓の変化は回復傾向を示し，その他の変化はいずれも回復した．

以上の結果から，テトラヒドロチオフェン -1,1-ジオキシドのラットへの28日間反復投与により，腎臓の病理学的変化および主に肝機能への影響が示唆される血液生化学的変化などが認められた。無影響量は雄で60 mg/kg/day，雌で200 mg/kg/dayと推定された．

方法

1.　被験物質

テトラヒドロチオフェン -1,1-ジオキシドは，分子量120.16，融点27.4〜27.8℃で，水および芳香族炭化水素に極めて溶け易く，水を3〜5%添加された無色透明の液体である．試験には，新日本理化(株)製造のもの〔ロット番号0007，純度95%，不純物として水5%を含む)〕を入手し，冷暗(4℃)条件下で密栓保管し，使用した．投与液は，被験物質を純度換算で所定の投与用量になるような濃度に局方精製水(共栄製薬)に溶解して調製し，使用時まで冷所(4℃)遮光下で密栓保管した．被験物質の原液および投与液中の被験物質は，安定であることを確認した．

2.　供試動物および飼育条件

日本チャールス・リバー (株)より搬入したSD系[Crj:CD(SD)]ラットを，雄は5日，雌は6日間検疫・馴化飼育し，5週齢(雄146-157 g，雌126-140 g)で，1群雌雄各6匹として試験に用いた．ラットは，温度22±3℃，湿度55±10％，換気回数10回以上/時，照明12時間(6-18時)に設定した飼育室で，金網ケージに個別に収容し，固型飼料［日本農産工業(株)，ラボMRストック］および水を自由に摂取させた．

3.　投与量および投与方法

テトラヒドロチオフェン -1,1-ジオキシドのラットにおける急性経口LD50値は，2100 mg/kgと報告1)されている．投与量設定試験は，5週齢のSD系ラットを1群雌雄各4匹とし，0，50，100，250，500あるいは1000 mg/kg/day用量の14日間反復経口投与により実施した．体重増加の抑制，摂餌量の減少および尿pHの上昇傾向が，500 mg/kg以上の雌雄に認められた．1000 mg/kgでは，投与5日頃まで初期体重を下回って推移し，雄の1匹は死亡した．さらに，雌雄にヘマトクリット値の増加が，雌に血清GOT，GPTの増加が，雄に総ビリルビンの増加およびカリウムの減少がそれぞれ認められた．剖検および器官重量においては，変化は認められなかった．したがって，本試験における投与量は，明らかな毒性影響の発現が予想される700 mg/kg/dayを最高用量とし，以下200および60 mg/kg/dayの3用量および対照を設定した．試験群は，以上の4群の他に，700 mg/kg/dayおよび対照の14日間回復群を設けた．投与は，テフロン製胃ゾンデを装着した注射筒を用いて，投与液を1日1回，28日間にわたって経口投与した．投与液量は，体重100 g当たり0.5 mlとした．対照群には溶媒として用いた局方精製水を同様に投与した．

4.　観察および検査項目

1)　一般状態観察

投与および回復期間中毎日，生死および外観，行動等を観察した．

2)　体重および摂餌量測定

体重は，投与 1日(投与初日の投与直前)，3日およびその後は週2回，3あるいは4日ごと，ならびに屠殺日に測定した．摂餌量は，ケージごとに週1回(雄は投与3，10，17，24日および投与終了後3，10日，雌は投与2，9，16，23日および投与終了後2，9日)，翌日までの24時間の飼料消費量を測定した．

3)　尿検査

雄は投与 23日および投与終了後11日，雌は投与24あるいは27日および投与終了後10日に，ラットを代謝ケージに約3時間収容して採尿し，外観の観察，比重の測定［屈折計，エルマ光学(株)］，pH，潜血，タンパク，糖，ケトン体，ビリルビン，ウロビリノーゲン［以上，マルティスティックス，マイルス・三共(株)］および沈渣(URI-CEL液で染色，ケンブリッジケミカルプロダクト社)の検査を行った．

4)　血液学検査

供試血液の採取は，投与期間および回復期間終了翌日における屠殺剖検時に行った．動物は採血前日の午後 5時より除餌し，水のみを給与した．腹大動脈から採取した血液は3分割し，その一部はEDTA-2Kで凝固防止処理し，多項目自動血球計数装置［東亜医用電子(株)，E-4000］により，赤血球数(電気抵抗検出方式)，血色素量(ラウリル硫酸ナトリウム-ヘモグロビン法)，ヘマトクリット値(パルス検出方式)，平均赤血球容積，平均赤血球血色素量，平均赤血球血色素濃度(以上，計算値)，白血球数および血小板数(以上，電気抵抗検出方式)を，また塗抹標本を作製して網状赤血球数(Brilliant cresyl blue染色)および白血球百分率(May-Giemsa染色)を測定した．さらに一部は3.8％クエン酸ナトリウム液で処理して血漿を得，血液凝固自動測定装置(アメルング社，KC-10A)により，プロトロンビン時間(Quick一段法)および活性化部分トロンボプラスチン時間(エラジン酸活性化法)を測定した．

5)　血液生化学検査

採取した血液の一部から血清を分離し，生化学自動分析装置［日本電子 (株)，JCA-VX-1000型クリナライザー］により，総タンパク(Biuret法)，アルブミン(BCG)，A/G比(計算値)，血糖，トリグリセライド，総コレステロール(以上，酵素法)，総ビリルビン(Jendrassik法)，尿素窒素(Urease-UV法)，クレアチニン(Jaff法)，GOT，GPT，γ-GTP(以上，SSCC法)，アルカリホスファターゼ(GSCC法)，コリンエステラーゼ(BTC-DTNB法)，カルシウム(OCPC法)および無機リン(酵素法)を，電解質自動分析装置［東亜電波工業(株)，NAKL-1］により，ナトリウム，カリウムおよび塩素を測定した．

6)　病理学検査

所定の投与期間あるいは回復期間終了翌日の採血に続いて放血屠殺し，剖検した．また，脳，心臓，胸腺，肝臓，腎臓，脾臓，副腎，精巣，精巣上体，卵巣を秤量した．病理組織学検査は，採取した器官を 10％中性リン酸緩衝ホルマリン液で固定後，対照群および700 mg/kg群では脳，脊髄，下垂体，眼球，甲状腺(上皮小体を含む)，胸腺，心臓，気管，肺，肝臓，腎臓，脾臓，副腎，胃，小腸(十二指腸・空腸・回腸)，大腸(盲腸・結腸・直腸)，膵臓，精巣，精巣上体，精嚢，前立腺，卵巣，子宮，膣，膀胱，リンパ節(頚部リンパ節，腸間膜リンパ節)，坐骨神経，骨髄について，60および200 mg/kg群ならびに回復群では，毒性影響がうかがわれた雄の腎臓を，さらに回復群については器官重量に変化の認められた雌の肝臓，脾臓，胸腺および血液検査で変化が認められたため雌雄の骨髄を検査した．検査は，常法によりパラフィン切片を作製し，ヘマトキシリン・エオジン染色を施して鏡検した．

5.　統計処理

得られた平均値あるいは頻度について， Dunnettの多重比較検定を行った．ただし，回復群については，t検定およびU検定を行った．

結果

1.　一般状態および死亡

一般状態の変化について，自発運動の低下が 700 mg/kg群で雌の12匹中3匹に認められた．これらの自発運動の低下は，いずれも投与3日のみに認められ一過性の変化であった．死亡は認められなかった．

2.　体重(Fig. 1)

700 mg/kgの体重は対照群を下回って推移し，雄は投与期間を通じて，雌は投与開始後14日までの体重に有意差が認められた．回復期間においては，700 mg/kgの回復群の体重増加量は雌雄とも対照群を上回り，有意に低値を示した雄の体重も，回復期間終了時には対照群との間に有意差は認められなくなった．

3.　摂餌量(Fig. 2)

摂餌量の有意な減少が， 700 mg/kg群で雄は投与1〜3週，雌は投与1週に認められた．700 mg/kgの回復群の摂餌量は，対照群に比べて，雄では差がなく，雌では投与終了後1週に有意に増加した．

4.　尿所見

投与および回復期間中の検査で，被験物質投与各群の雌雄とも，各検査項目に有意な変化は，認められなかった．

5.　血液学所見(Table 1，2)

被験物質投与各群の雄の平均赤血球血色素濃度は，対照群と比べて全般的にやや低値を示し，統計学的に有意差が認められた．しかし，変化傾向が用量依存的でなく，赤血球数，血色素量およびヘマトクリット値にも，有意な変化は認められなかった． 700 mg/kgの回復群においては，雄に有意な白血球数の増加が，雌に有意な赤血球数の減少および平均赤血球容積の増加が認められた．白血球の百分率には変化は認められなかった．

6.　血液生化学所見(Table 3，4)

700 mg/kg群で，雄に有意なコリンエステラーゼおよび総ビリルビンの増加，塩素の減少が，雌に有意なGPTの増加，グルコースの減少が認められた．なお，200 mg/kg群で，雄に有意な総タンパクの減少が，雌に有意なトリグリセライドの増加が認められたが，用量相関的な変化ではなかった．700 mg/kgの回復群においては，雄に有意なグルコースおよびクレアチニンの減少が認められた．しかし，投与期間終了時屠殺動物で認められた変化は認められなかった．

7.　剖検所見

腎臓の軽度な腫大が， 700 mg/kg群の雄6匹中2匹に認められた．回復群の剖検においては，異常は認められなかった．

8.　器官重量 (Table 5，6)

700 mg/kg群で，雄は腎臓の絶対重量が増加傾向を示し，相対重量は有意に増加した．また，雌では，脾臓の絶対重量が有意に減少し，相対重量も減少傾向を示した．なお，700 mg/kg群の雄で，脳および心臓は絶対重量に変化が認められなかったが，相対重量は有意に増加した．700 mg/kgの回復群においては，雌で脾臓の絶対および相対重量，胸腺の絶対重量ならびに脾臓の相対重量の有意な増加が認められた．しかし，投与期間終了時屠殺動物で認められた変化は認められなかった．

9.　病理組織学所見(Table 7，8)

投与期間終了時屠殺動物の検査において，被験物質の投与に起因すると考えられる変化が，雄の腎臓に認められた．すなわち，腎臓の近位尿細管上皮において，硝子滴の増加および好酸体の出現が 200および700 mg/kg群で認められた．また，好塩基性尿細管の目立つ例が700 mg/kg群で増加する傾向にあった．さらに，遠位尿細管の軽度な拡張が，200および700 mg/kg群の各1匹に認められた．雌の腎臓，ならびに器官重量で変化の認められた雄の脳，心臓および雌の脾臓を含むその他の器官には，被験物質投与との関連性がみられる変化は認められなかった．700 mg/kgの回復群においては，投与期間終了時屠殺動物の雄で認められた腎臓の変化は明らかに軽減あるいは消失し，回復傾向が認められた．器官重量に変化のみられた雌の肝臓，脾臓および胸腺には，被験物質投与の影響と考えられる変化は認められなかった．また，700 mg/kgの回復群の雌雄の骨髄にも異常は認められなかった．以上の所見の他にも，投与期間終了時屠殺動物および回復期間終了時屠殺動物において，検査した各器官に変化が認められたが，いずれも散発的で用量依存性はみられず，自然発生病変と考えられる所見であった．

考察

テトラヒドロチオフェン -1,1-ジオキシドの毒性について，ラットにおける急性経口LD50値は2100 mg/kgと報告1)されており，当研究所で実施した急性経口毒性試験においても，雄で2006 mg/kg，雌で2130 mg/kgと類似した結果が得られている2)．皮膚刺激性および感作性は，認められないことが報告1)されている．反復投与毒性に関しては，ラット，モルモット，イヌおよびサルに29〜95日間吸入させたAndersenら3)の報告があり，毒性変化として，被験物質の直接的な影響による肺の炎症性変化が各動物種で発現したほか，モルモットでは肝細胞の空胞化および肝機能障害を示唆する血液生化学的変化が認められている．

今回，テトラヒドロチオフェン -1,1-ジオキシドの0，60，200および700 mg/kg/day用量をラットに28日間経口投与して実施した反復投与毒性試験においては，肝臓に対する毒性影響を示唆する血液生化学的変化が認められたほか，腎臓の病理学的変化などが認められた．

一般状態の観察では， 700 mg/kg群の雌の少数に自発運動の低下が投与初期に一過性に認められた．

本被験物質の急性中毒症状として，痙攣等の中枢神経興奮症状が知られている 1)ほか，ゲッ歯類を用いた実験で，代謝率(酸素消費量)が減少し，体温や運動量が低下あるいは減少することが報告4,5)されている．本試験で認められた自発運動の低下は，急性毒性的な症状が軽度に現れたものと考えられる．

体重および摂餌量は， 700 mg/kg群の雌雄でいずれも対照群を下回ったが，投与の反復につれて変化は増強せず，雌の体重は投与後半に回復する傾向にあった．テトラヒドロチオフェン -1,1-ジオキシドは，ラットおよびウサギへの腹腔内投与において，主に3-ヒドロキシテトラヒドロチオフェン-1,1-ジオキシドとして尿中に排泄される6)．急性毒性症状の発現は，未変化体の血中濃度と相関することが知られている4)．尿中排泄速度は，ラットへの静脈内投与において，投与2日間の排泄量が約50%と遅いが，未変化体の血中半減期は3.5〜5時間と短い7)．

Alexanderら8)は、本被験物質の臭素化合物である3-ブロモテトラヒドロチオフェン-1,1-ジオキシドのラットおよびイヌを用いた反復経口投与毒性試験においても，毒性は投与の延長により増強しないことを報告している．

尿検査および血液学検査では，被験物質の投与に起因すると思われる変化は認められなかった．

血液生化学検査では， 700 mg/kg群において，いずれも有意な総ビリルビンおよびコリンエステラーゼの増加，塩素の減少が雄に，GPTの増加，グルコースの減少が雌に認められた．

肝臓に病理学的変化は認められなかったものの， GPTおよび総ビリルビンの増加は投与量設定試験においても認められており，肝臓に対する毒性影響を示唆する所見と解せられる．

コリンエステラーゼ，グルコースおよび塩素の変動については，いずれも当研究所における背景データの範囲内での軽度な変化であった．

病理学検査では，腎臓の近位尿細管上皮における好酸体や硝子滴の出現あるいは増加が， 200および700 mg/kg群の雄に認められた．700 mg/kg群の雄では，障害後の再生過程にあると思われる好塩基性尿細管が増加する傾向にあり，さらに，腎臓の有意な相対重量増加および肉眼的腫大例も認められた．

尿細管上皮における好酸体や硝子滴はラットに生理的にも認められ，タンパクの再吸収像と考えられている 9)．これらの増加は，腎臓におけるタンパクの再吸収あるいはその代謝過程に対する何らかの影響を示唆しているが，尿検査および血液生化学検査において，腎機能の異常をうかがわせる変化は認められなかった．

なお， 200および700 mg/kg群の雄に遠位尿細管の拡張が認められたが，軽度，かつ，各群1匹と発現率が低く，用量相関的な増加がみられていないことから，被験物質投与との関連性を判断するのは困難であった．

脾臓重量の減少傾向が， 700 mg/kg群の雌に認められた．組織学的には明らかな異常は認められなかったが，回復群においては逆にリバウンド現象とも考えられる重量増加が認められていることから，脾臓に対し何らかの影響を有する可能性が考えられた．

チオフェンは小脳顆粒細胞の壊死を起こすことが知られている 10)が，テトラヒドロチオフェン-1,1-ジオキシドのラットへの投与においては，脳に組織学的変化は認められなかった．700 mg/kg群の雄で相対重量増加が認められたが，絶対重量は対照群と比べ差はなく，体重増加抑制に伴う所見と判断された．

これらの投与期間中あるいは投与期間終了時屠殺動物の検査で認められた変化は，回復群において，腎臓の変化は回復傾向を示し，その他の変化はいずれも回復した．したがって，本被験物質の投与により発現する毒性変化は，可逆的であると判断される．

なお， 700 mg/kg群の投与期間終了時屠殺動物において，心臓重量の変化が雄に認められたが，絶対および相対重量に共通した変化ではなく，病理組織学的にも異常は認められなかったことから，主に体重増加の抑制に伴う所見と考えられた．また，同群の回復期間終了時屠殺動物においては，赤血球数の減少が雌に，白血球数の増加が雄に認められたが軽度な変化で，骨髄造血細胞には異常は認められなかった．さらに雌の肝臓，脾臓および胸腺重量の変化についても，病理組織学的には異常は認められなかった．したがって，回復群で認められた所見は，遅発的な毒性影響を示唆する変化ではないと判断された．

以上の結果から，テトラヒドロチオフェン -1,1-ジオキシドのラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験において，肝臓に対する毒性影響を示唆する血液生化学的変化，腎臓の病理学的変化などが発現した．無影響量は雄で60 mg/kg/day，雌で200 mg/kg/dayと推定された．

文献

1)V. K. H. Brown, L. W. Ferrigan, D. E. Stevenson, Brit. J. industr. Med., 23, 302(1966).
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10)R. M. Herndon, Exp. Brain Res., 6, 49(1968)

連絡先
試験責任者：伊藤義彦
試験担当者：迫川朋子，赤木　博，杉本忠美，
伊藤雅也，鈴木昭雄
（財）畜産生物科学安全研究所
〒229-11　神奈川県相模原市橋本台3-7-11
Tel 0427-62-2775Fax 0427-62-7979

Correspondence
Authors:Yoshihiko Ito(Study director)
Tomoko Sakogawa, Hiroshi Akagi, Tadami Sugimoto,
Masaya Ito, Teruo Suzuki
Research Institute for Animal Science in Biochemistry and Toxicology
3-7-11 Hashimotodai, Sagamihara-shi, Kanagawa, 229-11, Japan
Tel +81-427-62-2775Fax +81-427-62-7979