リン酸(2-エチルヘキシル)ジフェニルエステルの細菌を用いる
復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of Diphenyl 2-ethylhexyl phosphate on Bacteria

要約

リン酸(2-エチルヘキシル)ジフェニルエステルについて，細菌を用いる復帰突然変異試験を実施した．

検定菌として，Salmonella typhimurium(TA100，TA1535，TA98，TA1537)およびEscherichia coli(WP2 uvrA)を用い，プレインキュベーション法により実施した．予備試験の結果をもとに，本試験ではS9 mix非共存下および共存下の各菌株について5000〜313μg/プレート(公比2)の5濃度を設定した．

2回の本試験の結果とも，S9 mixの有無によらず，いずれの菌株においても陰性対照値の2倍以上を示す復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．

以上の結果より，本試験条件下ではリン酸(2-エチルヘキシル)ジフェニルエステルは，変異原性を有さない(陰性)と判定された．

方法

〔使用菌株〕

カリフォルニア大学 B.N. Ames 教授より1983年5月27日に入手したSalmonella typhimurium TA98，TA100，TA1535，TA1537 1)および東京大学医科学研究所 松島教授より1985年10月14日に入手したEscherichia coli WP2 uvrA 2)の5菌株を用いた．各使用菌株は超低温槽で-80℃以下に凍結保存した．

試験に際して，各凍結菌株を融解後，その20μlをニュートリエントブロス(Oxoid Nutrient Broth No.2，Unipath社)25 gを1 lの精製水に溶解して作成した液体完全培地10 mlに接種し，37℃で8時間振盪培養した．培養終了後の菌懸濁液は菌濃度を測定した後，試験に使用した．

〔被験物質〕

リン酸(2-エチルヘキシル)ジフェニルエステル(CAS No.:1241-94-7，ロット番号:K70801，純度:91.4%；大八化学工業(株)製造)は，分子量362.44の水に不溶の無色透明液体であり通常の取り扱い条件では安定である．なお，本ロットについては試験期間中安定であることを確認した.

リン酸(2-エチルヘキシル)ジフェニルエステルはジメチルスルホキシド(DMSO，ロット番号:708S1611，関東化学(株))を用いて最高濃度(50 mg/ml)の溶液を調製した後，同溶媒で公比2で希釈したものを用いた．

〔陽性対照物質〕

陽性対照物質として下記のものを用いた．
AF-2:2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(純度:98.8%，和光純薬工業(株))
NaN3:アジ化ナトリウム(純度:96.5%，和光純薬工業(株))
ENNG:N-エチル-N '-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(純度:99.0%，Sigma Chemical Co.)
9-AA:9-アミノアクリジン(純度:99%，Sigma Chemical Co.)
2-AA:2-アミノアントラセン(純度:98.0%，和光純薬工業(株))
NaN3は注射用水((株)大塚製薬工場)に，その他はDMSOに溶解したものを使用した.

〔培地およびS9 mixの組成〕

1)　トップアガー

アミノ酸水溶液として，精製水を用いてD-ビオチン，L-ヒスチジンおよびL-トリプトファンの0.5 mM混合水溶液を調製し，これをろ過滅菌後，冷蔵庫に保管した．精製水100 mlに対して，粉末寒天(Bacto-Agar；Difco社)0.6 g，塩化ナトリウム0.5 gの割合で加え，オートクレーブで滅菌し完全に溶解させた後，上記のアミノ酸水溶液を1/10量加えて混和し，約45℃に保温した．

2)　最少グルコース寒天平板培地

クリメディアAM-N培地(オリエンタル酵母工業(株))を購入し，使用した．なお，培地1 lあたりの組成は下記のとおりである．
硫酸マグネシウム七水塩0.2 g
クエン酸一水塩2 g
リン酸水素二カリウム無水塩10 g
リン酸-アンモニウム1.92 g
水酸化ナトリウム0.66 g
ブドウ糖20 g
寒天(OXOID Agar No.1)15 g
径90 mmのシャーレ1枚あたり30 mlを流して固めてある．

3)　S9 mix

S9 mix 1 mlあたり以下の組成で調製し，使用時まで氷中に保存した．
S9*0.1 ml
塩化マグネシウム六水塩8μmol
塩化カリウム33μmol
D-グルコース6-リン酸5μmol
β-NADPH4μmol
β-NADH4μmol
ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)100μmol
滅菌精製水残量
*:購入したS9(キッコーマン(株))を使用した．このS9は，7週齢の雄性SD系ラットにフェノバルビタールと5,6-ベンゾフラボンを併用投与して作製した肝ホモジネートの9000 × g 遠心上清分画である．

〔試験方法〕

試験はプレインキュベーション法で実施した．

試験管に被験物質溶液0.1 mlを分注し，0.1 Mナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)0.5 mlと菌懸濁液0.1 mlを加え，37℃で20分間振盪した．S9 mixを共存させる場合には，0.1 Mナトリウム-リン酸緩衝液の代わりに S9 mixを0.5 ml加えた．プレインキュベーション後，トップアガー2 mlを上記の試験管に加えて混和し，最少グルコース寒天平板培地に重層した．重層したトップアガーが凝固した後，37℃で48時間培養した．実体顕微鏡を用いて菌叢の生育状態を観察し，被験物質による抗菌性の有無を調べた後，プレート上の復帰変異コロニー数を自動コロニーカウンターで計測した．予備試験は各濃度あたり1 枚のプレートを使用した．本試験は各濃度あたり3枚のプレートを使用し，再現性を確認するため2回実施した．また，被験物質溶液の代わりに陰性対照物質(溶媒)および各菌株毎の陽性対照物質を用いて，被験物質群と同様の操作を行う対照群を設けた．

〔試験結果の判定基準〕

いずれかの試験菌株で，S9 mixの有無によらず，被験物質濃度の増加にともなって復帰変異コロニー数(平均値)が陰性対照値の2倍以上に増加し，さらにその増加に再現性が認められる場合に，当該被験物質は陽性と判定した．その他の場合はすべて陰性と判定した．試験結果の判定には統計学的手法は用いなかった．

結果および考察

〔予備試験〕

5000，1250，313，78.1，19.5，4.88，1.22μg/プレートの濃度で実施した結果，S9 mixの有無によらず，いずれの菌株においても抗菌性は認められなかった．従って，本試験ではS9 mix非共存下および共存下の各菌株について5000，2500，1250，625，313μg/プレートの5濃度を設定した．

〔本試験〕

結果をTable 1,2に示した．上記の濃度範囲で試験を実施した結果，2回の本試験ともにS9 mixの有無によらず，いずれの菌株においても陰性(溶媒)対照値の2倍以上を示す復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．また，抗菌性も，S9 mixの有無によらず，いずれの菌株においても認められなかった．

S9 mix非共存下および共存下の625μg/プレート以上で沈殿物が認められた．

以上の結果から，リン酸(2-エチルヘキシル)ジフェニルエステルの変異原性は陰性と結論した．

文献

1)D.M. Maron and B.N. Ames, Mutation Research，113, 173-215(1983).
2)M.H.L. Green and W.J. Muriel, Mutation Research，38, 3-32(1976).

連絡先
試験責任者：水野　文夫
試験担当者：榎本　佳明，石毛　裕子
(株)三菱化学安全科学研究所　鹿島研究所
314-02　茨城県鹿島郡波崎町砂山14
Tel 0479-46-2871Fax 0479-46-2874

Correspondence
Authors:Fumio Mizuno(Study director)
Yoshiaki Enomoto，Yuko Ishige
Mitsubishi Chemical Safety Institute Ltd.，Kashima Laboratory
14 Sunayama，Hasaki-machi，Kashima-gun，Ibaraki，314-02 Japan
Tel +81-479-46-2871Fax +81-479-46-2874