法)，GOT，GPT，γ-GTP，LDH(以上，SSCC法)，アルカリホスファターゼ(GSCC法)，コリンエステラーゼ(BTC-DTNB法)，カルシウム(OCPC法)および無機リン(酵素法)を，また電解質自動分析装置〔東亜電波工業(株)，NAKL-1〕により，ナトリウム，カリウムおよび塩素を測定した．
一方，雌親については，1000 mg/kg群の1匹が分娩中に瀕死状態となったので切迫屠殺した．また，同群の交配前期間中の体重増加量は減少した．さらに，雄親で認められたと同じ用量で同様の一般状態の変化，肝臓および副腎の病理組織学的変化ならびに肝臓重量の増加が認められた．腎臓においては，300および1000 mg/kg群で遠位尿細管の拡張および近位尿細管上皮の脂肪変性が認められた．
以上の結果から，ジアセトンアルコールのラットへの反復投与により，肝臓，腎臓，副腎などに対する毒性影響が認められ，無影響量は雄で30 mg/kg/day，雌で 100 mg/kg/dayと推定された．
投与期間中毎日，動物の生死，外観，行動等について観察した．
(2) 体重および摂餌量測定
体重の測定は，投与開始日(投与開始直前)およびその後は7日間隔で行い，さらに最終投与日と剖検日に測定した．ただし，雌の妊娠後は妊娠0，7，14および20 日と哺育0および4日に測定した．摂餌量は体重測定日に合わせて，翌日までの24時間の飼料消費量を測定した．摂餌量の最終測定は，雄は投与43日，雌は哺育3日に行った．交配期間中は摂餌量を測定しなかった．
(3) 交配および分娩状態観察
投与15日の午後に，雄のケージに同一群内の雌を入れて1対1の組み合わせを作り，交尾が確認されるまで(4 日間で全例の交尾を確認)連続同居させた．交尾の確認は毎朝一定時刻(9:30分頃)に行い，膣栓形成あるいは膣垢中に精子が確認された日を妊娠0日とした．分娩状態の観察も同じ時刻に行い，1腹全例の出産が確認された日を哺育0日とした．交配および分娩の観察結果から，各群について同居開始から交尾成立までの期間，交尾率〔(交尾動物数/同居動物数)×100〕，受胎率〔(受胎雌数/交尾雌数)×100〕および出産率〔(生児出産雌数/受胎雌数)×100〕ならびに分娩の確認された例について妊娠期間(妊娠0日から分娩が確認された日までの期間)を算定した．
(4) 雄の臨床病理学検査
尿検査:投与38日あるいは41日に腰部を刺激して新鮮尿を採取し，試験紙法(マイルス・三共(株)，マルティスティックス(R))によるpH，潜血，タンパク，糖，ケトン体，ビリルビンおよびウロビリノーゲンの定性的検査を行った．また，ラットを代謝ケージに収容(2〜3時間)して得た蓄尿について，外観の観察，比重の測定(エルマ光学(株)，屈折計)ならびに尿沈渣の検査を行った．
血液学検査:供試血液の採取は，投与期間終了翌日における屠殺剖検時に行った．動物は採血前日の午後5時より除餌し，水のみを給与した．採取した血液は3分割し，その一部はEDTA-2K処理し，多項目自動血球計数装置〔東亜医用電子(株)，E-4000〕により，赤血球数(電気抵抗検出方式)，血色素量(ラウリル硫酸ナトリウム-ヘモグロビン法)，ヘマトクリット値(パルス検出方式)，平均赤血球容積，平均赤血球血色素量，平均赤血球血色素濃度(以上，計算値)，白血球数および血小板数(以上，電気抵抗検出方式)を，また塗抹標本を作製して網状赤血球数(Brilliant cresyl blue染色)を測定した．さらに，一部は3.8％クエン酸ナトリウム液で処理して血漿を得，血液凝固自動測定装置(アメルング社，KC-10A)により，プロトロンビン時間(Quick一段法)および活性化部分トロンボプラスチン時間(エラジン酸活性化法)を測定した．
血液生化学検査:採取した血液の一部から血清を分離し，生化学自動分析装置〔日本電子(株)，JCA-VX-1000 型クリナライザー〕により，総タンパク(Biuret法)，アルブミン(BCG法)，A/G比(計算値)，グルコース，トリグリセライド，総コレステロール(以上，酵素法)，総ビリルビン(Jendrassik法)，尿素窒素(Urease-UV 法)，クレアチニン(Jaff法)，GOT，GPT，γ-GTP，LDH(以上，SSCC法)，アルカリホスファターゼ(GSCC法)，コリンエステラーゼ(BTC-DTNB法)，カルシウム(OCPC法)および無機リン(酵素法)を，また電解質自動分析装置〔東亜電波工業(株)，NAKL-1〕により，ナトリウム，カリウムおよび塩素を測定した．
(5) 病理学検査
瀕死動物は発見後速やかに，雄の計画屠殺動物は採血に続いて，雌の計画屠殺動物は哺育4日の観察終了後に，また，分娩予定日を過ぎても分娩が認められない雌は分娩予定の4日後に，哺育期間中に全児が死亡した雌は全児の死亡が確認された日に，いずれもエーテル麻酔下で放血屠殺し，脳，心臓，肝臓，腎臓，脾臓，副腎，胸腺ならびに雄についてはさらに精巣，精巣上体を秤量した．雌については，卵巣の黄体数および子宮の着床数を調べ，着床率［(着床数／黄体数)×100］を算定した．病理組織学検査は，採取した器官を10％中性リン酸緩衝ホルマリン液(精巣および精巣上体のみブアン液)で固定後，対照群および1000 mg/kg群の雌雄，ならびに他の群の妊娠の成立しなかった雌雄の脳，下垂体，眼球，甲状腺，上皮小体，胸腺，心臓，肺，肝臓，腎臓，副腎，脾臓，胃，小腸(十二指腸・空腸・回腸)，大腸(盲腸・結腸・直腸)，膵臓，膀胱，骨髄，さらに雄では精巣，精巣上体，前立腺，精嚢，雌では卵巣，子宮，膣，乳腺について，また，30，100および300 mg/kg群の妊娠が成立した動物では，1000 mg/kg群で毒性影響と考えられる変化の認められた雌雄の肝臓，副腎および雄の腎臓について，常法に従いパラフィン切片を作製し，ヘマトキシリン・エオジン染色を施して鏡検した．また，沈着物を同定するため，一部の例の腎臓および肝臓については PAS 染色あるいは脂肪染色も行った．
分娩完了の確認後各腹の産児数(生児と死亡児の合計)を調べ，分娩率〔(総出産児数／着床数)×100〕を算定した．また，性別は肛門と生殖突起の距離の長短により判定し，群ごとの性比を算出した．
(2) 外表異常および一般状態観察
分娩完了後，口腔内を含む外表の異常を観察した．また，毎日一般状態および生死を確認し，出生率〔(出産確認時生児数／総出産児数)×100〕および新生児生存率〔(哺育4日生児数／出産確認時生児数)×100〕を求めた．
(3) 体重測定
哺育0および4日に，雌雄別に各腹ごとの総体重を測定し，1匹当たりの平均体重を算出した．
(4) 病理学検査
死亡例は発見時に，生存例は雌親の解剖時(哺育4日)にエーテル・クロロホルムで麻酔死させ，胸腹部における主要器官を肉眼的に観察した．
法(群の大きさが異なる場合)により対照群に対する各群の比較検定を行った．カテゴリカルデータは，χ^2検定を行った．なお，新生児に関するデータは，1腹当たりの平均を1標本とした．
1000 mg/kg群で1匹認められた分娩後全児が死亡した雌においては，異常は認められなかった．1000 mg/kg群の雌で切迫屠殺した1匹では，肝臓の腫大/退色，副腎の肥大，腺胃と小腸(主に回腸)の粘膜に黒色点の散在および脾臓の萎縮が認められた．
妊娠を成立させた雄において，肝臓に小葉中心性肝細胞肥大が1000 mg/kg群で6匹中3匹に認められた．腎臓には近位尿細管上皮における硝子滴の増加が100 mg/kg群で8匹中6匹，300 mg/kg群で9匹中9匹，1000 mg/kg群で5匹に認められ，変化の程度も用量依存的に増強する傾向にあった．また，腎臓で好塩基性尿細管の目立つ例が300 mg/kg群で5匹，1000 mg/kg群で3匹に，遠位尿細管のびまん性拡張が1000 mg/kg群で3匹に認められた．副腎には，皮質束状帯細胞の空胞化が300 mg/kg群で1匹，1000 mg/kg群で3匹に認められた．分娩し哺育も順調であった雌においては，肝臓に小葉中心性肝細胞肥大が1000 mg/kg群で4匹中4匹に認められた．腎臓には，びまん性遠位尿細管拡張および近位尿細管上皮の脂肪変性がいずれも300 mg/kg群で9匹中2匹および1000 mg/kg群で1匹に認められた．副腎には皮質束状帯細胞の空胞化が300 mg/kg群で1匹に認められた．妊娠の成立しなかった雄では小葉中心性肝細胞肥大が1000 mg/kg群で4匹中2匹に，腎臓近位尿細管上皮における硝子滴の増加が300 mg/kg群で1匹中1匹，1000 mg/kg群で4匹中4匹，好塩基性尿細管の目立つ例が300 mg/kg群で1匹，1000 mg/kg群で3匹，びまん性遠位尿細管拡張が1000 mg/kg群で1匹に，副腎皮質束状帯細胞の空胞化が1000 mg/kg群で2匹，束状帯の肥大が1匹に認められた．妊娠の成立しなかった雌では小葉中心性肝細胞肥大および腎臓のびまん性遠位尿細管拡張が 1000 mg/kg群で各1匹，副腎皮質束状帯細胞の空胞化が 1000 mg/kg群で3匹に認められた．哺育期間中に全児が死亡した1000 mg/kg群の雌1匹においては，小葉中心性肝細胞肥大が認められた．しかし，これら妊娠を成立させなかった雌雄や全児が死亡した雌においても，下垂体および生殖器系器官に被験物質の投与に起因すると考えられる変化は認められなかった．1000 mg/kg群の雌で切迫屠殺した1匹においては，生存例の変化に比べて強い腎臓の位尿細管上皮の脂肪変性および遠位尿細管のびまん性拡張が認められたほか，小葉中心性肝細胞壊死，腺胃および回腸粘膜の壊死，副腎皮質束状帯細胞の肥大，ならびに脾臓および胸腺の萎縮が認められた．以上の所見以外にも検査した各器官に変化が認められたが，散発的あるいは用量依存的な発現傾向のみられない所見であった．
交尾は同居開始4日以内に，対照群および被験物質投与各群の全例に成立した．交尾に要する日数にも差は認められなかった．受胎率は，統計学的有意差は認められなかったものの，1000 mg/kg群で低下傾向が認められた．
(2) 黄体数，着床数および着床率
1000 mg/kg群で，統計学的有意差は認められなかったものの，着床数および着床率の減少傾向が認められた．黄体数には変化は認められなかった．
(3) 出産率および妊娠期間
出産率は，対照群および被験物質投与各群とも100％であった．妊娠期間にも変化は認められなかった．
(4) 分娩および哺育状態
1000 mg/kg群で切迫屠殺した例は，分娩予定日(妊娠22日)の夕方に膣出血が認められ，翌日に1匹の頭部が膣口まで下降したが，親動物は衰弱していて娩出できなかった．剖検で，膣に下降した1匹の死亡児以外に，子宮内に残留した17匹の死亡児が確認された．また，1000 mg/kg群の別の1匹は，分娩予定日の夕方に分娩が認められたが翌朝の分娩の観察時には1 匹のみが確認され，残りは捕食されていた．この1匹の新生児も翌日までに死亡した．
1000 mg/kg群で，統計学的有意差は認められなかったものの，総出産児数，分娩率，新生児数，出生率，哺育4日生児数および哺育4日生存率に，いずれも減少傾向が認められた．性比には変化は認められなかった．
(2) 体重
被験物質投与各群の雌雄とも，哺育0日および4日の体重に，変化は認められなかった．
(3) 形態
外表異常については，対照群の1匹で眼瞼開裂および無顎症の重複異常，1000 mg/kg群の1匹で痕跡尾が認められたが，被験物質の投与に起因すると考えられる異常は認められなかった．内臓異常は，いずれの児動物にも認められなかった．内臓変異については，胸腺の頚部残留，左臍動脈遺残あるいは腎盂の拡張が，総計対照群で7匹(4.7％)，30 mg/kg群で5匹(2.7％)，100 mg/kg群で3匹(2.1％)，300 mg/kg群で11匹(7.3％)，1000 mg/kg群で6匹(11.7％)に認められ，1000 mg/kg群の発現率は対照群と比べやや高い傾向にあったが，有意な差ではなかった．
病理学検査において，肝臓，腎臓および副腎に変化が認められた．肝臓については，肝細胞の肥大が 1000 mg/kg群で認められ，同群の肝臓重量は増加した．血液生化学検査で認められたGOT，コリンエステラーゼ，総タンパク，総コレステロールおよび総ビリルビンの増加は，肝機能に対する影響を示唆する変化と考えられる．アセトンは酵素誘導を起こすことが知られている5)．一般状態の変化が投与の反復につれて消失したこと，血清総タンパクの増加および肝細胞の肥大が認められたことなどから，ジアセトンアルコールの投与においても，酵素誘導が発現している可能性が考えられる．また，GOT および総ビリルビンの増加が認められたことから，ジアセトンアルコールは肝臓に対し，障害的に影響するものと判断される．
腎臓については，腎臓重量の増加が300および1000 mg/kg群に認められた．組織学的には，近位尿細管上皮における硝子滴の増加が100 mg/kg以上の群に，過剰の硝子滴の沈着による障害後の再生像と考えられる好塩基性尿細管の増加が300 mg/kg以上の群に認められた．また，遠位尿細管の拡張が1000 mg/kg群に認められた．遠位尿細管の拡張は，下部尿路に尿の停滞を起こすような変化を伴ってないことから，遠位尿細管における水分の再吸収に対する被験物質の軽度な影響を示唆する変 化6)と推察される．1000 mg/kg群では，血液尿素窒素およびクレアチニンが増加し，腎機能の低下がうかがわれた．尿検査では，異常は認められなかった．
副腎については，皮質束状帯細胞の空胞化が300 mg/kg以上の群で認められた．1000 mg/kg群では束状帯細胞の肥大例も認められ，副腎重量は増加した．
以上の変化に加えて，1000 mg/kg群でグルコースの減少ならびに血小板数およびカルシウムの増加が認められた．体重および摂餌量には変化は認められなかった．
一方，雌親においては，交配前期間中の体重増加量が 1000 mg/kg群で減少したほか，雄親と同様の一般状態の変化が300および1000 mg/kg群で認められた．また，肝臓には肝細胞の肥大および肝臓重量の増加が，副腎には皮質束状帯細胞の空胞化が1000 mg/kg群で認められた．腎臓においては，近位尿細管上皮の脂肪変性および遠位尿細管の拡張が300および1000 mg/kg群で認められた．1000 mg/kg群の1匹は分娩中に衰弱し，瀕死状態となったので切迫屠殺した．この例の病理組織学検査では，腎臓の変化は生存例と比べて強く，また副腎皮質束状帯の肥大が認められたほか，生存例には認められなかった肝細胞の小葉中心性壊死および消化管粘膜の壊死が認められた．肝細胞の壊死はジアセトンアルコールが肝臓に対し障害的に影響することを裏付ける変化と判断され，また消化管粘膜の壊死については，ジアセトンアルコールは局所刺激性を有する3)ことから，被験物質の影響が強く現れたものと推察される．
以上の結果から，ジアセトンアルコールのラットへの反復投与により，肝臓，腎臓，副腎などに対する影響が認められた．無影響量は，雄で30 mg/kg/day，雌で 100 mg/kg/dayと推定された．
受胎率は，1000 mg/kg群で低下傾向が認められた．受胎率の低下における雄親の関与について，精巣および精巣上体の重量に変化は認められず，これら器官および下垂体に病理組織学的変化も認められなかった．しかしながら，Dietzら7)は，アセトンのラットへの飲水投与において，精巣に病理組織学的変化は認められないが精子の運動性の低下および異常精子の増加が認められたことを報告している．したがって，ジアセトンアルコールも雄ラットに対して同様の影響を有する可能性が考えられ，雄親の授胎能に対する影響を完全に否定することはできないものと考えられる．
1000 mg/kg群では受胎率の低下傾向に加えて，着床数および着床率の減少傾向が認められ，着床に対する影響も認められた．黄体数，出産率および妊娠期間には，被験物質の投与による影響は認められなかった．
分娩および哺育状態について，分娩中に瀕死状態となり切迫屠殺した1000 mg/kg群の1匹は，1児が膣に下降し，残りは子宮に残留していた．また，1000 mg/kg群の別の1匹は，分娩予定の夕方に分娩が認められたが翌朝の分娩観察時までに1匹を残して他は捕食し，1匹の新生児もその翌日までに死亡した．これら分娩あるいは哺育状態に異常の認められた2例のうち，切迫屠殺例は前述の病理学的所見から，重度な一般毒性学的影響により分娩困難となったものと推察される．一方，全児が死亡した例では肝細胞の肥大は観察されたが，生殖能に影響を及ぼすと考えられる一般毒性学的変化は認められなかった．
児動物の発生については，1000 mg/kg群で総出産児数，分娩率，新生児数，出生率，哺育4日生児数および哺育4日生存率の減少傾向が認められた．新生児の体重および形態には変化は認められなかった．
これら1000 mg/kg群で認められた親動物の生殖能および児動物の発生に関する指標の変化は，いずれも統計学的には有意な変化ではなかったが，被験物質の投与による影響が軽度に発現したものと判断される．300 mg/kg以下の群では変化は認められなかった．
以上の結果から，ジアセトンアルコールのラットへの投与において，受胎，着床，分娩，哺育および児動物の生存性に対する影響を示唆する変化が認められ，雌雄親動物の生殖能および児動物の発生に対する無影響量は，いずれも300 mg/kg/dayと推定された．
| 1) | G. D. DiVincerzo, Toxicol. Appl. Pharmacol., 36(3)，511(1976). |
| 2) | M. L. Richardson, "The dictionary of substances and their effects," Vol.3, ed. by Royal society of chemicals, England, 1993, pp.93-95. |
| 3) | C. C. Carpenter, Am. J. Ophthalmol, 29, 1363(1946). |
| 4) | H. F. Smyth, Jr. and C. P. Carpenter, J. Ind. Hyg. Toxicol., 30(1), 63(1948). |
| 5) | D. R. Koop, B. L. Crump, G. D. Nordblom and M. J. Coon, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 4065(1985). |
| 6) | 渡辺満利，“毒性試験講座5-毒性病理学,”前川昭彦，林裕造編，地人書館，東京，1991，pp.267-293. |
| 7) | D. D. Dietz, J. R. Leininger, E. J. Rauckman, M. B. Thompson, R. E. Chapin, R. L. Morrissey and B. S. Levine, Fundam. Appl. Toxicol., 17, 347(1991). |
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