4-アミノフェノールのラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of 4-Aminophenol in Rats

要約

4-アミノフェノールは，芳香族系有機化合物で医薬中間体(アセトアミノフェン・解熱鎮痛剤)，硫化染料の中間体，ゴム用老化防止剤，毛皮用酸化染料や写真現像薬として用いられる1)．今回，4-アミノフェノールを0，4，20，100および500 mg/kgの用量でSD系ラットの雌雄に28日間反復経口投与し，その毒性について検討した．対照群，100および500 mg/kg群については14日間回復群を設けた．

投与開始後4日に500 mg/kg群の雄1例が死亡した．病理組織学検査の結果，腎臓に広範な近位尿細管上皮の凝固壊死が認められ，本変化が死亡原因と考えられた．

一般状態観察では，自発運動量の低下が500 mg/kg 群の雄1例で認められた．体重と摂餌量の低値が 500 mg/kg群の雄，摂水量の高値が500 mg/kg 群の雌雄で認められた．血液学検査では，赤血球数の低値が500 mg/kg群の雌雄，ヘマトクリット値とヘモグロビン濃度の低値および網状赤血球数の高値が 500 mg/kg 群の雌，平均赤血球血色素量の高値が500 mg/kg 群の雄で認められた．血液生化学検査では，アルブミンの高値が 500 mg/kg群の雄で認められた．尿検査では，褐色尿が 100 および 500 mg/kg 群の雌雄，比重の高値が500 mg/kg群の雌，沈渣の上皮細胞の増加が100 mg/kg群の雌と500 mg/kg群の雌雄で認められた．病理学検査では，肝臓の絶対重量あるいは相対重量の高値が500 mg/kg 群の雌雄，脾臓の相対重量の高値，暗赤色化およびヘモジデリン色素の増加が500 mg/kg群の雌と髄外造血の亢進が500 mg/kg群の雌雄，腎臓の絶対重量と相対重量の高値が100 mg/kg 群の雌と 500 mg/kg群の雌雄，皮髄境界部の白色線条が500 mg/kg群の雌雄，好塩基性尿細管が100および500 mg/kg群の雌雄で認められた．これらの変化は，投与を止めることにより軽減ないし回復していた．20 mg/kg群では被験物質に起因した変化は認められなかった．

以上の結果より，本試験条件下における4-アミノフェノールの無影響量は，雌雄ともに20 mg/kg/dayであると判断した．

方法

1．被験物質

4-アミノフェノール(三井東圧化学(株)，CAS No. 123-30-8，Lot No. 89-021，純度99.0％)は，融点 189.6〜190.2℃，沸点284℃，水に難溶の無色ないし淡紫色結晶である．本ロットは投与期間中安定であることが確認された．投与液は被験物質を0.5％カルボキシメチルセルロース・ナトリウム水溶液に懸濁させ調製し，冷蔵保存した．投与液中の被験物質は冷蔵保存条件下で1日間安定であり，使用した投与液にはほぼ所定量の被験物質が均一に含有されていることを確認した．

2．試験動物および飼育条件

日本チャールス・リバー(株)より入手したSD系ラット(Crj:CD,SPF)の雌雄を9日間検疫・馴化し，試験に使用した．投与開始前に体重別層化無作為抽出法により群分けした．1群の動物数は雌雄各6匹とし，対照群，100 および500 mg/kg群については雌雄各6匹の14日間回復群を設けた．投与開始時の週齢は5週齢，体重範囲は雄が177〜206 g，雌が139〜170 gであった．

検疫・馴化期間を含めた全飼育期間中，温度20〜25℃，湿度40〜70％，換気約12回／時，照明12時間(7:00〜19:00)に自動調節された飼育室を使用した．動物は，実験動物用床敷(ベータチップ:日本チャールス・リバー(株))を敷いたポリカーボネート製ケージに1ケージあたり2匹で収容し飼育した．

動物には，実験動物用固型飼料(MF:オリエンタル酵母工業(株))および5μmのフィルター濾過後，紫外線照射した水道水を，それぞれ自由に摂取させた．

3.　投与量および投与方法

被験物質を0，100，500および1000 mg/kgの各用量でSD系ラットに14日間反復経口投与した結果，1000 mg/kg群では雄2例，雌1例が死亡し，流涎，体重増加抑制，前胃粘膜のびらんあるいは潰瘍が認められた．500 mg/kg群では，体重増加抑制，摂水量の高値，肝臓と腎臓の相対重量の高値および腎臓の皮髄境界部の褪色が認められた．従って，本試験では高用量を500 mg/kgとし，以下公比5で中用量を100および 20 mg/kg，低用量を4 mg/kg とした．被験物質は28日間毎日1回，午前中に胃ゾンデを用いて強制経口投与した．投与液量は10 mL/kgとし，至近測定日の体重を基に算出した．対照群には同様に溶媒を投与した．

4．観察および検査方法

1)　一般状態，体重，摂餌量および摂水量

全例について一般状態を毎日観察した．体重，摂餌量および摂水量は投与開始日およびその後毎週1回測定した．摂餌量と摂水量については，各期間毎の1匹あたりの1日平均摂取量を算出した．

2)　血液学検査

各計画殺時の全動物について，チオペンタールナトリウムの腹腔内投与による麻酔下で後大静脈より採血し，赤血球数(シースフローDCインピーダンス検出法)，白血球数(RF/DCインピーダンス検出法)，血小板数(シースフローDCインピーダンス検出法)，ヘモグロビン濃度(SLSヘモグロビン法)，ヘマトクリット値(赤血球パルス波高値検出法)を多項目自動血球分析装置(NE-4500:東亞医用電子(株))，白血球百分率(Wright染色塗抹標本)を血液細胞自動分析装置(MICROX HEG-70A:立石電機(株))，網状赤血球数(アルゴンレーザーを用いたフローサイトメトリー法)を自動網赤血球測定装置(R-2000:東亞医用電子(株))，プロトロンビン時間(PT；Quick一段法)，活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT；活性化セファロプラスチン法)を血液凝固自動測定装置(KC10A:アメルング社)により測定した．また，検査の結果から平均赤血球容積(MCV)，平均赤血球血色素量(MCH)，平均赤血球血色素濃度(MCHC)を算出した．凝固阻止剤として，プロトロンビン時間および活性化部分トロンボプラスチン時間測定には3.13％クエン酸ナトリウム水溶液を，それ以外の項目の測定には EDTA-2K を用いた．

3)　血液生化学検査

採取した血液の一部を約30分間静置した後，3000 r.p.m.で10分間遠心分離し，得られた血清を用いてGOT(SSCC改良法)，GPT(SSCC改良法)，ALP(GSCC改良法)，γ-GTP(SSCC 改良法)，尿素窒素(Urease-GLDH法)，グルコース(GK-G6PDH法)，総コレステロール(CES-CO-POD法)，トリグリセライド(LPL-GK-G3PO-POD法)，クレアチニン(Jaff法)，総蛋白(Biuret法)，アルブミン(BCG法)，A/G比(総蛋白およびアルブミンより算出)，カルシウム(O-CPC法)，無機リン(UV法)，ナトリウム，カリウム，クロール(イオン選択電極法)を自動分析装置(日立736-10形:(株)日立製作所)により測定した．

4)　尿検査

投与開始後26日および回復開始後12日に各群雌雄6匹の新鮮尿を採取して，pH，潜血，蛋白，糖，ケトン体，ビリルビン，ウロビリノーゲン(試験紙法，マルティスティックス,マイルス・三共(株))を尿分析器(クリニテック100:マイルス・三共(株))，尿量をメスシリンダー，比重(屈折法)を尿比重計(ユリコン-S:アタゴ社)，ナトリウムおよびカリウム(炎光光度法)を全自動炎光光度計(FLAME-30C/AD-3:(株)日本分光メディカル)，クロール(電量滴定法)をクロライドメーター(Model 925:コーニングメディカル(株))により測定し，沈渣(Sternheimer-Malbin染色)を鏡検した．

5)　病理学検査

各計画殺時，全例について採血後に腹大動脈を切断して放血致死させ剖検した．死亡動物は発見後すみやかに剖検した．死亡動物以外の全例の脳，肝臓，腎臓，副腎，胸腺，脾臓，精巣および卵巣の重量を測定した．また，全例の上記器官に加え，下垂体，眼球，ハーダー腺，肺，胃，甲状腺および上皮小体，心臓，膀胱，骨髄(大腿骨)を採取し，10％中性リン酸緩衝ホルマリン液で固定，保存した．ただし，死亡動物以外の眼球およびハーダー腺はDavidson液で固定した．

投与期間終了時解剖動物の対照群および 500 mg/kg 群の雌雄の心臓，肝臓，脾臓，腎臓，副腎，胃および骨髄(大腿骨)と全例の肉眼的異常部位を対象に，常法に従いヘマトキシリン・エオジン染色標本を作製し鏡検した．また，一部の動物の脾臓については，ベルリンブルー染色標本を作製し，鏡検した．死亡動物については上記器官に加え肺と胸腺も検査した．その結果，脾臓，腎臓および胃に被験物質投与に起因すると考えられる変化が認められたため，投与期間終了時解剖動物の他の群と回復試験終了時解剖動物の全例の当該器官を検査した．また，器官重量で変化がみられた肝臓についても全例を検査した．

6)　統計解析

計量データについてはBartlett法による等分散の検定を行い，分散が一様の場合は一元配置分散分析を行った後，Dunnett法またはScheff法により検定した．分散が一様でない場合はKruskal-Wallisの検定を行い，Dunnett型または Scheff型の順位和検定を行った．計数データおよび病理組織所見については，Armitageのχ^2 検定を行った．有意水準は5％未満とした．

結果

1．一般状態および死亡

投与開始後4日に500 mg/kg群の雄1例が死亡した．生存動物の一般症状として，自発運動量の減少が500 mg/kg群の雄1例で投与開始後4〜6日に認められた．回復期間中には，本変化は認められなかった．また，投与後の流涎が500 mg/kg群の雄で投与開始後20日以降，雌で投与開始後11日以降，投与前の流涎が500 mg/kg 群の雌で投与開始後18日以降に認められた．投与後の流涎は，投与直後に一過性に発現し，投与前の流涎は動物の体に触れることにより発現した．自発運動量の低下が500 mg/kg群の雄1例で投与開始後4〜6日に認められた．回復期間中には，これらの変化は認められなかった．

2．体重(Fig.1)

体重の低値が投与開始後7日に500 mg/kg群の雄で認められ，それ以降の投与期間中も有意ではないが低値傾向が継続してみられた．回復期間中には，本変化は認められなかった．

3．摂餌量

摂餌量の低値が投与開始週に500 mg/kg群の雄で認められた．回復期間中には，本変化は認められなかった．

4．摂水量

摂水量の高値が500 mg/kg群の雄で全投与期間中，雌で投与開始後3週に認められた．回復期間中にも500 mg/kg群の雌雄で高値あるいは高値傾向が継続して認められた．

5．血液学検査(Table 1)

投与期間終了時の検査で，赤血球数の低値が500 mg/kg群の雌雄，ヘマトクリット値とヘモグロビン濃度の低値および網状赤血球数の高値が500 mg/kg群の雌，MCHの高値が500 mg/kg群の雄で認められた．回復期間終了時の検査では，赤血球数の低値が500 mg/kg群の雌雄で認められたが，その程度は軽減していた．また，MCHおよびMCVの高値が500 mg/kg群の雌で認められた．

回復期間終了時の検査で，赤血球数の高値とMCHおよびMCVの低値が100 mg/kg群の雄，白血球百分率のリンパ球比の高値が500 mg/kg群の雌，好酸球比の高値が100 mg/kg群の雌で認められたが，いずれも軽微な変動であることやその発現状況から被験物質に起因した変化ではないと判断した．

6．血液生化学検査(Table 2)

投与期間終了時の検査で，アルブミンの高値が500 mg/kg群の雄で認められた．回復期間終了時の検査では，本変化は認められなかった．

なお，回復期間終了時の検査でアルカリフォスファターゼの高値が500 mg/kg群の雄，カルシウムの高値が100 mg/kg群の雄で認められたが，軽微な変動であることやその発現状況から被験物質に起因した変化ではないと判断した．

7．尿検査(Table 3)

投与期間中の検査で，褐色尿が100および500 mg/kg群の雌雄，比重の高値が500 mg/kg群の雌で認められた．また，沈渣の上皮細胞の増加が100 mg/kg群の雌と500 mg/kg群の雌雄で認められた．回復期間中の検査では，これらの変化は認められなかった．

なお，投与期間中あるいは回復期間中の検査で蛋白の低値が20および500 mg/kg群の雄，ケトン体の低値が500 mg/kg群の雄，ケトン体の高値が4 mg/kg群の雄，沈渣の精子の増数が 100 mg/kg 群で認められたが，いずれも軽微な変動であることやその発現状況から，被験物質に起因した変化ではないと判断した．

8．器官重量(Table 4)

投与期間終了時の検査で，肝臓の絶対重量の高値が500 mg/kg群の雌，肝臓の相対重量の高値が500 mg/kg群の雌雄，腎臓の絶対重量の高値が100および500 mg/kg群の雌，腎臓の相対重量の高値が500 mg/kg群の雌雄で認められた．また，脾臓の相対重量の高値が500 mg/kg群の雌で認められた．回復期間終了時の検査では，肝臓の相対重量の高値が500 mg/kg群の雌雄，腎臓の相対重量の高値が500 mg/kg群の雌で継続して認められたが，その程度は軽減していた．

なお，回復期間終了時の検査で胸腺の絶対重量の高値が500 mg/kg群の雄，胸腺の相対重量の高値が100 mg/kg群の雌と500 mg/kg群の雄，脳の絶対重量の低値が100および500 mg/kg群の雌で認められたが，投与期間終了時にはみられないことから被験物質に起因した変化ではないと判断した．

9．剖検所見(Table 5)

投与期間終了時の検査で，脾臓の暗赤色化が500 mg/kg群の雌全例，腎臓の皮髄境界部の白色線条が500 mg/kg群の雄3例と雌全例に認められた．回復期間終了時の検査では，脾臓の暗赤色化が500 mg/kg群の雌全例に認められたが，腎臓の皮髄境界部の白色線条は認められなかった．投与開始後4日に死亡した500 mg/kg群の雄1例では，主な変化として腎臓の皮髄境界部の白色線条と前胃の限局性のびらんないし潰瘍が認められた．

その他，投与期間終了時および回復期間終了時の検査で，被験物質投与群に種々の変化がみられたが，その発現状況からいずれも被験物質に起因した変化ではないと判断した．

10．病理組織所見(Table 6)

投与期間終了時解剖動物の検査で，脾臓の赤脾髄における赤芽球系造血細胞の増生からなる髄外造血の亢進が 500 mg/kg群の雄1例，雌5例とヘモジデリン色素の増加が500 mg/kg群の雌5例に認められた．また，腎臓の好塩基性尿細管が100 mg/kg群の雄1例，雌4例および 500 mg/kg群の雄4例，雌全例に認められた．本変化は主に皮髄境界部に発現し，好塩基性化した尿細管上皮細胞は腫大し，有糸分裂像もしばしば認められた．また，一部の尿細管は拡張し，腔内には変性・脱落した上皮細胞が認められた．さらに1〜2例では間質における炎症性細胞浸潤と鉱質沈着が伴われていた．回復期間終了時解剖動物の検査では，脾臓の髄外造血の亢進が500 mg/kg群の雌2例，ヘモジデリン色素の増加が500 mg/kg群の雌全例，腎臓の好塩基性尿細管が500 mg/kg群の雄3例に認められた．投与開始後4日に死亡した500 mg/kg群の雄1例では，主な変化として腎臓の広範な近位尿細管上皮の凝固壊死と好塩基性尿細管，前胃の限局性のびらんないし潰瘍が認められた．

その他，被験物質投与群で種々の変化が認められたが，いずれもラットではしばしば認められる自然発生性の変化であることや，その発現状況から被験物質に起因した変化ではないと判断した．

考察

4-アミノフェノールを0，4，20，100，500 mg/kgの用量でSD系ラットの雌雄に28日間反復経口投与し，その毒性について検討した．

投与開始後4日に500 mg/kg群の雄1例が死亡した．病理組織学検査の結果，腎臓の皮髄境界部に広範な近位尿細管上皮の凝固壊死が認められた．類似の変化は化学物質による中毒や虚血性の循環障害によって発現することが知られており，重篤な場合は急性腎不全となり死に至る2)．本試験の死亡動物は，被験物質の尿細管上皮に対する影響が強く現れた結果，急性死したものと思われる．また，本例では被験物質に起因すると思われる前胃の限局性のびらんないし潰瘍が認められた．

生存動物では，一般症状として自発運動量の減少が500 mg/kg群の雄で認められたが，投与初期に1匹のみで認められただけであった．投与前後の流涎が500 mg/kg群の雌雄で認められた．しかし，投与後の流涎は投与直後に発現する一過性の変化であり，投与前の流涎は動物の体に触れることによって発現する条件反射的な変化であることや，これらの変化は投与を止めることにより発現しないことから，被験物質の味等に起因した変化であり，毒性学的意義はないと判断した．従って，流涎は無影響量の評価の対象からは除外した．

体重および摂餌量の低値あるいは低値傾向が500 mg/kg群の雄で認められた．本変化は，投与を止めることにより回復した．

摂水量の高値が500 mg/kg群の雌雄で認められた．また，尿検査で褐色尿が100および500 mg/kg群の雌雄，沈渣の上皮細胞の増加が100 mg/kg群の雌と500 mg/kg群の雌雄で認められた．これらは後述する腎臓の変化に関連した変化と思われる．なお，摂水量の高値あるいは高値傾向は回復期間中も500 mg/kg群の雌雄で継続して認められたが，尿の変化は投与を止めることにより回復した．

血液学検査で赤血球数の低値が500 mg/kg群の雌雄，ヘマトクリット値とヘモグロビン濃度の低値および網状赤血球数の高値が500 mg/kg群の雌，MCHの高値が 500 mg/kg群の雄で認められた．病理組織学検査の結果，脾臓の赤芽球系造血細胞の増数を特徴とした髄外造血の亢進が500 mg/kg群の雌雄，ヘモジデリン色素の増加が500 mg/kg群の雌で認められており，被験物質投与による溶血の可能性が示唆された．回復期間終了時解剖動物では，上記変化のうち赤血球数の低値，脾臓のヘモジデリン沈着および髄外造血亢進が継続して認められたが，ヘモジデリン沈着以外の変化は軽減しており回復傾向がみられた．

血液生化学検査では，アルブミンの高値が500 mg/kg群の雄で認められた．同群では肝臓の重量増加がみられることから，肝臓での蛋白合成亢進に伴う変化と思われる．本変化は投与を止めることにより回復した．

病理学検査では，前述の脾臓の変化の他に肝臓の絶対重量あるいは相対重量の高値が500 mg/kg群の雌雄で認められた．しかし，病理組織学検査では異常は認められなかった．回復期間終了時にも肝臓の相対重量の高値が 500 mg/kg 群の雌雄で認められたが，その程度は軽減しており回復傾向がみられた．また，腎臓の絶対重量あるいは相対重量の高値と皮髄境界部の白色線条が500 mg/kg群の雌雄，有糸分裂を伴う好塩基性尿細管が100 および500 mg/kg群の雌雄で認められた．死亡した500 mg/kg群の雄で皮髄境界部の尿細管上皮の壊死が認められていることや，好塩基性尿細管は再生像であることから，投与初期に近位尿細管上皮の傷害性変化が起こり，引き続き再生性変化が進行したものと思われる．回復期間終了時解剖動物では，好塩基性尿細管が500 mg/kg群の雄で認められたが，その発現頻度は減少しており徐々に回復していくものと思われる．

以上の結果から，本試験条件下における4-アミノフェノールの無影響量は雌雄ともに20 mg/kg/dayと考えられる．

文献

1)化学工業日報社編，“12093 の化学商品,”化学工業日報社，東京，1993，p.541.
2)榎本眞，赤崎兼義，“毒性病理学・泌尿器系病変,” 榎本眞，赤崎兼義編，ソフトサイエンス社，東京，1987，pp.171-187.
連絡先
試験責任者：須藤雅人
試験担当者：関根美代，土谷　稔，山岸保彦，豊田直人，高野克代，
水嶋亜弥子，井澤　修，鈴木美江
(株)三菱化学安全科学研究所　鹿島研究所
〒314-02　茨城県鹿島郡波崎町砂山14
Tel 0479-46-2871Fax 0479-46-2874

Correspondence
Authors:Masato Sudo(Study director)
Miyo Sekine，Minoru Tsuchitani，Yasuhiko Yamagishi，Naoto Toyota, Katsuyo Takano，Ayako Mizushima，Osamu Izawa，Yoshie Suzuki
Mitsubishi Chemical Safety Institute Ltd., Kashima Laboratory
14 Sunayama, Hasaki-machi, Kashima-gun, Ibaraki, 314-02 Japan
Tel +81-479-46-2871Fax +81-479-46-2874