3-アミノベンゼンスルホン酸のラットを 用いる28日間反復経口投与毒性試験
Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of
3-Aminobenzenesulfonic acid in Rats
要約
3-アミノベンゼンスルホン酸（CAS No.121-47-1）の100，300および1000mg/kg/dayをラットに28日間経口反復投与し，その毒性および回復性について試験を実施して，以下の知見を得た．
飲水量の増加が1000mg/kg群の雄で投与期間の後期に，また，尿pHの低下が1000mg/kg群の雌雄に認められたが，これらの変化は14日間の休薬により消失し，回復性があることが確認された．その他に一般状態観察，体重推移，摂餌量，血液学的検査，血液化学的検査，器官重量，剖検および病理組織学的検査では，被験物質投与による影響は認められなかった．以上のことから，本試験における3-アミノベンゼンスルホン酸投与による無影響量（NOEL）は 雌雄ともに300mg/kg/dayであると考えられた．
方法
1．動物および飼育条件
生後4週齢のCrj:CD（SD）系のSPFラットを，日本チャールス・リバーより受け入れ，雄8日間雌9日間馴化飼育した後，順調な発育を示し，眼底に異常のみられない動物を試験に用いた．
動物は，温度23±3℃ ，湿度55±10％，換気回数10〜15回／時間および照明時間午前8時〜午後8時に設定された飼育室において，ブラケット式金属製金網床ケージに収容して飼育した．飼料は固型飼料（CRF-1，オリエンタル酵母工業）を，飲料水は水道水を，それぞれ自由摂取させた．飼料の混入物質および飲料水の水質について検査を実施し，異常のみられないことを確認した。
2．被験物質
3-アミノベンゼンスルホン酸（Lot No.：20060，純度：98.6％，製造者：三和化学工業）は染料の製造過程の中間体で，水に溶けにくい無臭の白ないし薄い灰色の粉末である．被験物質は試験実施期間中の品質が保証されており，密閉容器にいれ，湿気，直射日光を避けて冷暗所に保管した．投与液は，被験物質濃度が1，3および10w/v％となるように0.5％カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液（以下，0.5％CMC-Na溶液，日本薬局方 CMC-Na，丸石製薬；日本薬局方精製水，ヤクハン製薬）で懸濁して用時調製した．
3．試験群の設定
本試験の用量設定試験（14日間反復経口投与試験）の結果，高用量である1000mg/kg群で飲水量の増加が認められ，300および100mg/kg群で異常は認められなかったことから，本試験では投与期間の延長を考慮して1000mg/kg/dayを高用量とし，以下，公比約3で300および100mg/kg/day，さらに0.5％CMC-Na溶液を投与する対照群を設け，計4群とした．
群分けは，投与開始前日に各群の体重が均一になるように体重別層化無作為抽出法により行った．1群の動物数は，対照群および1000mg/kg群で雌雄各14匹，100および300mg/kg群で雌雄各7匹とし，そのうち対照群および1000mg/kg群の雌雄各7匹を14日間の回復性試験に割りあてた．
4．投与方法
投与経路は経口とし，投与は胃ゾンデを用いて強制的に胃内に行い，1日1回連続28回行った．また，回復性試験の日数は14日間とした．投与容量は，体重1kg当たり10mlとして投与日に最も近い日に測定した体重に基づいて算出した．投与は5週齢から開始し，平均体重（体重範囲）は雄で151.4g（142〜161g），雌で134.7g（126〜145g）であった．
5．観察，測定および検査項目
(1) 一般状態観察，体重，摂餌量および飲水量測定
一般状態は，1日1回以上の頻度で観察した．体重は，投与1日（投与前），投与2，7，14，21および28日，回復1，2，7および14日および剖検日に測定した．摂餌量および飲水量測定は，剖検日を除いて体重測定と同じ日に測定した．
(2) 尿検査
投与25〜26日および回復11〜12日に代謝ケージに収容して非絶食下で採尿を行った．約3時間の蓄尿についてpH，蛋白，糖，ケトン体および潜血反応（以上，試験紙マルティスティックス；マイルス・三共），沈渣（鏡検）を検査し，21時間蓄尿について尿量を測定した．
(3) 剖検および器官重量測定
投与期間および回復期間終了の翌日に，エーテル麻酔下で採血後，放血致死させ，剖検した．器官重量は脳，下垂体，甲状腺，肺，心臓，肝臓，腎臓，脾臓，副腎，精巣および卵巣について測定し，器官体重重量比を算出した．
(4) 血液学的検査
剖検時に雄の全例について約16時間絶食した後，エーテル麻酔下で大腿静脈より採血し，無処理血液を用いて凝固時間（流体粘度変化による空気圧測定法：グライナー社製 マイクロコアグロメーター）を，EDTA・2Kで処理した血液を用いて赤血球数，平均赤血球容積，血小板数，白血球数（以上，電気抵抗法），血色素量（シアンメトヘモグロビン法），ヘマトクリット値（RBC,MCVより算出），平均赤血球ヘモグロビン量（RBC,Hbより算出），平均赤血球ヘモグロビン濃度（Ht,Hbより算出），（以上，コールターカウンターT660型），網赤血球率（Brecher法），白血球型別百分率(鏡検）を測定した．さらに，腹部大動脈より採血し，クエン酸ナトリウムで処理した後、3000rpmで10分間遠心分離して得られた血漿を用いてプロトロンビン時間（トロンボプラスチン法）および活性化部分トロンボプラスチン時間（エラジン酸法）（以上，AMELUNG KC-10A バクスターKK）を測定した．
(5) 血液化学的検査
剖検時に雄の全例について，血液学的検査のための採血後，腹部大動脈より採血し3000rpmで10分間遠心分離して得られた血清を用いてGOT，GPT（以上，IFCC法），γ-GTP（包接L-γ-グルタミル-p-ニトロアニリド基質法），アルカリフォスファターゼ（ベッセイ・ローリー法），乳酸脱水素酵素（ロブレスキュラー・ラ・デュー法），コリンエステラーゼ（ヨウ化ブチリルチオコリン基質法），血糖（ヘキソキナーゼ法），総コレステロール，リン脂質（以上，酵素法），トリグリセリド（遊離グリセロール法），総ビリルビン（アゾビリルビン法），尿素窒素（ウレアーゼ・インドフェノール法），クレアチニン（ヤッフェ法），カルシウム（OCPC法），無機リン（フィスケ・サバロー法），総蛋白（ビウレット法），アルブミン（BCG法），A/G比（TP，Alpより算出），（以上，日立7150形自動分析装置），カリウム，ナトリウム（以上，炎光法：コーニング 480型炎光光度計），クロール（電気滴定法：平沼 CL-6M型クロライドカウンター），蛋白分画（電気泳動法）を測定した．
(6) 病理組織学的検査
肝臓，腎臓，脾臓，心臓，肺，脳（大脳・小脳），下垂体，副腎，甲状腺，上皮小体，胸腺，腸間膜リンパ節，膵臓，舌，下顎リンパ節，顎下腺，舌下腺，耳下腺，乳腺，皮膚，胸骨および大腿骨（骨髄を含む），脊髄（頚部），骨格筋（外側広筋），胸部大動脈，喉頭，気管，気管支，食道，胃（前胃・腺胃），十二指腸，空腸，回腸，盲腸，結腸，直腸，膀胱，精巣，精巣上体，精嚢，前立腺，卵巣，子宮，腟，坐骨神経および異常所見部位について10％中性緩衝ホルマリン液で，眼球およびハーダー腺をデビッドソン液で固定し，パラフィン包埋後薄切し，ヘマトキシリン・エオジン染色あるいは1000mg/kg群の異常所見例 2 例の肝臓または腎臓について，エラスチカ・ワンギーソン染色標本を作製し，鏡検した．
6．統計処理
各種検査の数量的項目はBartlettの検定法によって分散を検定した．その結果，等分散（P>0.05）を示した項目は一元配置分散分析法によって解析し，有意な場合（P<0.10）には，Dunnettの検定法（各試料の大きさが違う場合は有効反復数を用いた）により対照群と被験物質投与群との比較を行った．不等分散（P<0.05）を示した項目および尿検査の定性的項目はKruskal-Wallis法により解析し，有意な場合（P<0.10）には，Mann-WhitneyのU-検定法により対照群と被験物質投与群との比較を行った．なお，対照群との検定は危険率5％以下を統計学的に有意とした．
結果
1．一般状態，体重（Table 1，2）および摂餌量
雌雄ともに被験物質投与と関連した変化は認められなかった．
2．飲水量（Table 3，4）
1000mg/kg群の雄で投与期間の後期に飲水量の増加がみられ，投与14および21日に有意差が認められた．
3．尿検査（Table 5，6）
投与期間最終週では1000mg/kg群の雌雄で尿pHの低下が認められた．回復期間最終週では1000mg/kg群の雌で尿量の減少が認められた．
4．血液学的検査および血液化学的検査検査(Table 7〜10)
雌雄ともに被験物質投与と関連した変化は認められなかった．
5．器官重量，剖検および病理組織学的検査(Table 11，12)
雌雄ともに被験物質投与と関連した変化は認められなかった．
考察
飲水量の増加が1000mg/kg群の雄で投与期間の後期に認められた．同様の変化は本被験物質の1000mg/kgを14日間反復投与した雄にも認められ，被験物質投与による影響と考えられた．しかしながら，本試験では，投与28日の飲水量および投与期間最終週の尿量に有意な差が認められないほど軽微なものであり，また，行動にも異常は認められなかった．
尿pHの低下が1000mg/kg群の雌雄で認められ，また，その値は被験物質投与群で用量依存的な傾向がみられた．この原因として，被験物質投与液が酸性であること（1％水溶液でpH2.4）から被験物質あるいはその代謝物が尿中に排泄され尿pHを低下させた可能性が考えられた．なお，本試験における尿pH値は試験施設の背景データ（雌雄ともにpH6.0〜8.5）の範囲内の変動であり，尿定性および尿量，泌尿器系に被験物質投与による影響は認められないことから，泌尿器系に対し障害性を有する変化ではないものと考えられた．上述の投与期間中に認められた変化はいずれも14日間の休薬により消失し，回復性があることが確認された．他に，回復期間終了時に1000mg/kg群の雌で尿量の減少が認められたが，投与期間中に同様な変化はみられないことから，この変化は同時期の体重や飲水量の低値に起因するものであり，被験物質投与との関連はないものと考えられた．
その他に一般状態，体重推移，摂餌量，血液学的検査，血液化学的検査，器官重量，剖検および病理組織学的検査では被験物質投与による影響は認められなかった．
以上より，本試験における3-アミノベンゼンスルホン酸投与による無影響量(NOEL)は雌雄ともに300mg/kg/dayであると考えられた．
| 連絡先 |
| 試験責任者： | 釜田 悟 |
| 試験担当者： | 八幡昭子，常見邦順，小林裕幸，長谷淳一，岡澤平一 |
| (株)化合物安全性研究所 |
| 〒004 北海道札幌市豊平区真栄363番24号 |
| Tel 011-885-5031 | Fax 011-885-5313 | |
| Correspondence |
| Authors: | Satoru Kamada (Study director)，
Akiko Yahata，
Kuninori Tsunemi，
Hiroyuki Kobayashi，
Jyun-ichi Nagaya，
Heiichi Okazawa， |
| Safety Research Institute for Chemical Compounds Co., Ltd. |
| 363-24 Shin-ei，Toyohira-ku，Sapporo，Hokkaido，004，Japan |
| Tel +81-11-885-5031 | Fax +81-11-885-5313 | |