その結果，2回の本試験とも用いた5種類の検定菌のいずれの用量においても，溶媒対照値の2倍以上となる復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．
以上の結果から，トリメチル亜リン酸は，用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した．
S. typhimuriumの4菌株は1975年10月31日にアメリカ合衆国，カリフォルニア大学のB. N. Ames博士から分与された．
E. coli WP2 uvrA株は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与された．
検定菌は-80℃以下で凍結保存したものを用い，各菌株の特性確認は，凍結保存菌の調製時に，アミノ酸要求性，UV感受性，膜変異(rfa)およびアンピシリン耐性因子pKM 101(プラスミド)の有無について調べ，特性が維持されていることを確認した．
試験に際して，ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid Ltd.)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し，37℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした．
分光光度計により660 nmの吸光度を測定し，検定菌液の増殖を確認した．
トリメチル亜リン酸は，ジメチルスルホキシド(DMSO，和光純薬工業(株)，ロット番号:TPJ5678)に溶解して最高用量の調製液を調製した後，同溶媒で所定の濃度に希釈して速やかに試験に用いた．
| AF2 | : | 2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(和光純薬工業(株)) |
| SA | : | アジ化ナトリウム(和光純薬工業(株)) |
| 9AA | : | 9-アミノアクリジン(Sigma Chem. Co.) |
| 2AA | : | 2-アミノアントラセン(和光純薬工業(株)) |
AF2，9AAおよび2AAはDMSOに，SAは超純水に溶解したものを-20℃で凍結保存し，解凍後，速やかに試験に用いた．
| (A) | バクトアガー(Difco Lab.) | 0.6 w/v% |
| 塩化ナトリウム | 0.5 w/v% | |
| (B)* | L-ヒスチジン | 0.5 mM |
| D-ビオチン | 0.5 mM |
| * | : | WP2 uvrA用には，0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた． |
| 硫酸マグネシウム・7水和物 | 0.2 g |
| クエン酸・1水和物 | 2 g |
| リン酸水素二カリウム | 10 g |
| リン酸一アンモニウム | 1.92 g |
| 水酸化ナトリウム | 0.66 g |
| グルコース | 20 g |
| 大洋寒天(清水食品) | 15 g |
径90 mmのシャーレ1枚あたり30 mLを流して固めたものである．
| S9** | 0.1 mL |
| 塩化マグネシウム | 8 μmol |
| 塩化カリウム | 33 μmol |
| グルコース-6-リン酸 | 5 μmol |
| NADH | 4 μmol |
| NADPH | 4 μmol |
| ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4) | 100 μmol |
| ** | : | 7週齢のSprague-Dawley系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および5,6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製されたS9(キッコーマン(株))を用いた． |
小試験管中に，被験物質調製液0.1 mL，リン酸緩衝液0.5 mL(S9 mix添加試験においてはS9 mix 0.5 mL)，検定菌液0.1 mLを混合し，約45℃に保温したトップアガー2 mLを加えて混和し，合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりに使用溶媒，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．各検定菌ごとに用いた陽性対照物質の名称および用量は各 Table中に示した．同時に実施した試験については，溶媒および陽性対照群を共通とした．培養は37℃で48時間行い，生じた復帰変異コロニー数を目視またはコロニーアナライザーを用いて算定した．抗菌性の有無については，肉眼あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌叢の状態から判断した．用いた平板は用量設定試験においては，溶媒および陽性対照群では3枚ずつ，各用量については1枚ずつとした．また，本試験においては，両対照群および各用量につき，3枚ずつを用い，それぞれの平均値と標準偏差を求めた．用量設定試験は1回，本試験は2回実施し，結果の再現性を確認した．
したがって，本試験における最高用量は，S9 mix無添加試験および添加試験とも5000 μg/plateとした．
313〜5000 μg/plateの範囲で公比を2として2回の本試験を実施した(Table 1, 2)．その結果，すべての検定菌において，2回の試験とも溶媒対照値の2倍以上となる復帰変異コロニー数の増加は認められず，陰性であった．
以上の結果に基づき，トリメチル亜リン酸は，用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した．
なお，本被験物質はチャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験では，S9 mix存在下において染色体の構造異常および倍数性細胞の出現頻度に有意な増加が認められ，陽性であった3)．また，本被験物質の類縁化合物のDibutyl phosphate4)については，復帰変異試験および染色体異常試験共に陰性の結果が，Trimethyl phosphate5)については，染色体異常試験で陰性の結果が得られている．
| 1) | D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983). |
| 2) | S. Venitt, C. Crofton-Sleigh, "Evaluation of Short-Term Tests for Carcinogens," eds. by F. J. de Serres, J. Ashby, Elsevier, North-Holland, New York, 1981, pp. 351-360. |
| 3) | 厚生省生活衛生局企画課生活化学安全対策室監修，"化学物質毒性試験報告，"Vol. 7，化学物質点検推進連絡協議会，東京，1999, p. 466. |
| 4) | 厚生省生活衛生局企画課生活化学安全対策室監修，"化学物質毒性試験報告，"Vol. 2，化学物質点検推進連絡協議会，東京，1995, p. 55. |
| 5) | 厚生省生活衛生局企画課生活化学安全対策室監修，"化学物質毒性試験報告，"Vol. 3，化学物質点検推進連絡協議会，東京，1996, p. 285. |
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