窒化ケイ素のラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of Silicone nitride in Rats

要約

窒化ケイ素を雌雄ラットに28日間経口投与し，その毒性について検討した．一部の動物については，14日間の回復期間を設けた．投与量は，1000 mg/kgを高用量とし，以下300および100 mg/kgとした．対照として媒体(0.5 %カルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液)投与群を設けた．各群の使用動物数は，対照群，300および1000 mg/kg群で投与期間終了時剖検例雌雄各6例と回復期間終了時剖検例雌雄各6例の雌雄各12例，100 mg/kg群で投与期間終了時剖検例雌雄各6例とした．

死亡および瀕死例は，いずれの群にも認められなかった．一般状態観察において，いずれの群にも異常はみられなかった．体重，摂餌量，摂水量，尿検査，血液学検査，血液生化学検査，剖検所見，器官重量および病理組織学検査には，投与による変化はみられなかった．

以上のことから，窒化ケイ素は雌雄とも1000 mg/kg投与しても毒性学的影響を生じないと判断される．したがって，当試験条件下における窒化ケイ素の毒性学的無影響量は，雌雄とも1000 mg/kg/dayと考えられる．

方法

1.　被験物質および媒体

被験物質の窒化ケイ素は，水，アセトン，DMSOに不溶の灰白色系の粉末である[Lot No. 00205，純度:約97 %，ただし，不純物としてFeを520 ppm，Alを820 ppm，Caを110 ppm，Oを1.7 %含む，電気化学工業(株)(東京都)]．入手後は，室温・防湿条件下で保管した．

窒化ケイ素は，0.5 %カルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液で懸濁して調製した．なお，被験物質の調製に際して，純度による換算を実施した．2〜200 mg/mLの調製液は，室温・遮光条件下で6時間保存しても安定性に問題のないことが確認されているため，各濃度の調製液は，用時調製とし，調製後6時間以内に使用した．雄投与開始日および雄投与終了日に使用した各投与検体中の被験物質濃度を測定した結果，被験物質濃度に問題はなかった．

2.　使用動物および飼育条件

4週齢のSprague-Dawley系雌雄ラット[Crj:CD(SD)IGS，SPF]を日本チャールス・リバー(株)から購入した．入手した動物は，5日間の検疫期間およびその後雄は7日間と雌は9日間の馴化期間を設け，一般状態および体重推移に異常がみられなかった動物を群分けした．群分けは，コンピュータを用いて体重を層別に分けた後に，無作為抽出法により各群の平均体重および分散がほぼ等しくなるように投与開始日に行った．

動物は，室温20〜26 ℃，湿度40〜70 %，明暗各12時間(照明:午前6時〜午後6時)，換気回数12回/時に維持されている飼育室で飼育した．検疫・馴化期間中はステンレス製ケージを用いて1ケージ当たり5匹までの群飼育とし，群分け後はステンレス製ケージを用いて個別飼育した．飼料は，固型飼料(CRF-1，オリエンタル酵母工業(株))を自由に摂取させた．ただし，剖検前日の午後4時頃から絶食した．飲料水は，水道水を自由に摂取させた．

3.　投与経路，投与方法，投与量および投与期間

投与経路は，経口投与を選択した．投与に際しては，金属製経口胃ゾンデを取り付けたポリプロピレン製ディスポーザブル注射筒を用いて，強制経口投与した．投与液量は，投与日あるいは投与日に最も近い測定日の体重を基準とし，5 mL/kgで算出した．投与回数は1日1回とした．投与開始日の週齢は雌雄とも6週齢であり，体重範囲は雄が168〜183 g，雌が135〜151 gであった．

投与量は，ラットを用いた14日間反復経口投与予備毒性試験(投与段階:0，125，250，500および1000 mg/kg，各群雄5例)の結果により決定した．すなわち，1000 mg/kg投与しても，一般状態，体重，摂餌量および剖検所見に異常はみられなかった．そこで，当試験の投与量は，1000 mg/kgを高用量とし，以下公比約3により300および100 mg/kgとした．また，対照として媒体(0.5 %カルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液)のみを同容量投与する群を設けた．各群の動物数は，対照群，300および1000 mg/kg群では投与期間終了時剖検例雌雄各6例と回復期間終了時剖検例雌雄各6例の雌雄各12例，100 mg/kg群では投与期間終了時剖検例雌雄各6例とした．

投与期間は，28日間連続投与とした．また，28日間の投与後14日間の回復期間を設けた．なお，投与開始日を投与1日とし，最終投与の翌日を回復1日とした．

4.　観察および検査項目

1)　一般状態

一般状態および死亡の有無は，投与期間中には投与前・後の1日2回ならびに回復期間中には毎日1回観察した．

2)　体重測定

体重は，投与期間中および回復期間中とも1週間に2回測定した．

3)　摂餌量測定

摂餌量は，投与期間中および回復期間中とも1週間に1回測定した．

4)　摂水量測定

摂水量は，投与期間中および回復期間中とも1週間に1回測定した．

5)　尿検査

投与期間終了前および回復期間終了前に採尿ケージを用いて絶食・給水下で新鮮尿を採取した．その後，引き続いて給餌・給水下で24時間尿を採取した．採取した尿について，以下の検査を実施した．

新鮮尿:色調は，外観判定とした．pH，蛋白質，ブドウ糖，ケトン体，ビリルビン，潜血，ウロビリノーゲンは，尿検査試験紙(ウロペーパー栄研 7，栄研化学(株))と尿自動分析装置(US-2100，栄研化学(株))を用いて検査した．尿沈渣は，尿沈渣染色液(Sternheimer変法，和光純薬工業(株))で染色後に顕微鏡下で観察した．なお，採尿は，当日の検体投与前に行った．

24時間尿:尿量は，比重と重量から算出した．比重は，屈折率により屈折型尿比重計(ユリペット-D，(株)ニコン)を用いて測定した．

6)　血液学検査

最終投与の翌日および回復期間終了後に，ペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与による麻酔下で腹大動脈から血液を採取し，以下の血液学検査を実施した．

赤血球数(RBC)，ヘモグロビン，ヘマトクリット，血小板数および白血球数(WBC)は，EDTA-2K処理した血液について，多項目自動血球計数装置(Sysmex K-4500，シスメックス(株))を用いて測定した．さらに，平均赤血球容積(MCV)，平均赤血球血色素量(MCH)および平均赤血球血色素濃度(MCHC)を算出した．

網状赤血球比率は，EDTA-2K処理した血液をBrecher法により超生体染色後，Giemsa染色標本を作製して顕微鏡下で赤血球1000個中の網状赤球数を計数して算出した．

白血球百分率は，EDTA-2K処理した血液のMay-Giemsa染色標本を作製して顕微鏡下で白血球100個を分類計数して算出した．

プロトロンビン時間(PT)，活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)およびフィブリノーゲンは，血液を3.13 %クエン酸ナトリウムで処理後，遠心分離(約4 ℃，3000 rpm，15分間)して得た血漿について，散乱光検出方式により血液凝固分析装置(コアグマスター，三共(株))を用いて測定した．

7)　血液生化学検査

血液学検査用の血液と同時期に腹大動脈から採取した血液から遠心分離(約4 ℃，3000 rpm，15分間)して得た血清について，以下の血液生化学検査を実施した．

ASTはMDH-UV法，ALTはLDH-UV法，ALPはρ-ニトロフェニルリン酸基質法，γ-GTPはL-γ-グルタミル-3-カルボキシ-4-ニトロアニリド基質法，総蛋白はBiuret法，総ビリルビンは安定化ジアゾニウム塩法，尿素窒素はウレアーゼ・GlDH法，クレアチニンはクレアチニ ナーゼ・F-DAOS法，ブドウ糖はヘキソキナーゼ・G-6-PDH法，総コレステロールはCOD・HDAOS法，トリグリセライドはGPO・HDAOS法，Caはο-CPC法，無機リンはPNP・XDH法，Na，KおよびClはイオン選択電極法により，いずれも生化学自動分析装置(AU 400，オリンパス光学工業(株))を用いて測定した．

アルブミンは総蛋白および蛋白分画[電気泳動法，自動電気泳動装置(AES 310，オリンパス光学工業(株))]から，A/G(アルブミン/グロブリン)は蛋白分画から算出した．

8)　剖検

採血した動物をさらに放血致死させた後に剖検した．脳(大脳，小脳，延髄)，下垂体，甲状腺，胸腺，心臓，肝臓，脾臓，腎臓，副腎，精巣，精巣上体および卵巣は重量を測定した(ただし，下垂体および甲状腺は20 %中性緩衝ホルマリンに一晩固定後測定した)．これらの器官は，肺，気管，膵臓，唾液腺(舌下腺・顎下腺)，食道，胃，十二指腸，空腸，回腸，盲腸，結腸，直腸，リンパ節(下顎・腸間膜)，膀胱，精嚢，前立腺，子宮，腟，上皮小体，脊髄，坐骨神経，眼球，ハーダー腺，胸骨，大腿骨および乳腺とともに20 %中性緩衝ホルマリンに固定した．ただし，精巣および精巣上体はブアン液に2〜3時間固定後90 %アルコールに再固定し，眼球はグル タールアルデヒド・ホルマリンに一晩固定後20 %中性緩衝ホルマリンに再固定した．

9)　病理組織学検査

投与期間終了時剖検例の対照群および1000 mg/kg群について，各器官・組織のHE染色組織標本を作製し，病理組織学検査を実施した．

5.　統計解析

統計解析は下記に示したように，対照群と各投与群の間で行い，危険率を5 %とした．

体重，摂餌量，摂水量，尿量，尿比重，血液学検査成績，血液生化学検査成績および器官の絶対および相対重量は，各群で平均値および標準偏差を算出した．その後，Bartlett法による等分散性の検定を行い，等分散の場合にはDunnett法により行った．一方，等分散と認められなかった場合は，順位を利用したDunnett型の検定法により行った．

結果

1.　一般状態

死亡および瀕死例は，雌雄のいずれの群にも認められなかった．

一般状態観察において，雌雄ともいずれの群にも異常はみられなかった．

2.　体重(Fig. 1, 2)

雌雄の各投与群とも，対照群と比べて各測定日の体重に有意差はみられなかった．

3.　摂餌量(Fig. 3, 4)

雌雄の各投与群とも，対照群と比べて各測定日の摂餌量に有意差はみられなかった．

4.　摂水量(Fig. 5, 6)

雌雄の各投与群とも，対照群と比べて各測定日の摂水量に有意差はみられなかった．

5.　尿検査

1)　投与期間終了前(Table 1, 2)

雌雄の各投与群とも，対照群と比べて尿量および比重に有意差はみられなかった．

色調，pH，蛋白質，ブドウ糖，ケトン体，ビリルビン，潜血，ウロビリノーゲンおよび沈渣は，雌雄の各投与群とも対照群とほぼ同程度であった．

2)　回復期間終了前(Table 3, 4)

雄においては，各投与群とも対照群と比べて尿量および比重に有意差はみられなかった．

雌においては，300 mg/kg群では対照群と比べて尿量および比重に有意差はみられなかった．1000 mg/kg群では，対照群と比べて尿量の有意な低値および比重の有意な高値がみられたが，投与期間終了前には差の認められない変化であり，投与による影響とは考えられない．

色調，pH，蛋白質，ブドウ糖，ケトン体，ビリルビン，潜血，ウロビリノーゲンおよび沈渣は，雌雄の各投与群とも対照群とほぼ同程度であった．

6.　血液学検査

1)　投与期間終了時(Table 5)

雄においては，100および1000 mg/kg群では対照群と比べて各測定項目に有意差はみられなかった．300 mg/kg群では，対照群と比べて血小板数の有意な低値がみられたが，1000 mg/kg群で差が認められなかったことから，投与に基づく変化ではないと判断される．

雌においては，1000 mg/kg群では対照群と比べて各測定項目に有意差はみられなかった．100mg/kg群では対照群と比べて赤血球数の有意な低値およびMCHの有意な高値，300 mg/kg群ではフィブリノーゲンの有意な高値がみられたが，1000 mg/kg群でそれらの項目に有意差が認められなかったことから，投与に基づく変化ではないと判断される．

2)　回復期間終了時(Table 6)

雌雄の各投与群とも，対照群と比べて各測定項目に有意差はみられなかった．

7.　血液生化学検査

1)　投与期間終了時(Table 7)

雌雄の各投与群とも，対照群と比べて各測定項目に有意差はみられなかった．

2)　回復期間終了時(Table 8)

雌雄の各投与群とも，対照群と比べて各測定項目に有意差はみられなかった．

8.　剖検

1)　投与期間終了時

雄においては，対照群，100および300 mg/kg群では異常はみられなかった．1000 mg/kg群では，精巣(左)と精巣上体(左)の萎縮がみられたが，1例のみであり，偶発所見と判断される．

雌においては，いずれの群とも，異常はみられなかった．

2)　回復期間終了時

雌雄のいずれの群とも，異常はみられなかった．

9.　器官重量

1)　投与期間終了時(Table 9)

雄においては，剖検日の体重は各投与群とも対照群と比べて有意差はみられなかった．器官重量において，1000 mg/kg群では対照群と比べて各器官の絶対重量および相対重量に有意差はみられなかった．100 mg/kg群では対照群と比べて精巣の相対重量の有意な高値，300 mg/kg群では心臓の相対重量の有意な高値がみられたが，1000 mg/kg群でそれらの器官重量に有意差が認められなかったことから，投与に基づく変化ではないと判断される．

雌においては，各投与群とも対照群と比べて剖検日の体重ならびに各器官の絶対重量および相対重量に有意差はみられなかった．

2)　回復期間終了時(Table 10)

雌雄の各投与群とも，対照群と比べて剖検日の体重ならびに各器官の絶対重量および相対重量に有意差はみられなかった．

10.　病理組織学検査(Table 11)

1)　投与期間終了時雄

1000 mg/kg群では，肝臓において限局性の肝細胞壊死，微小肉芽腫および胆管増生，腎臓において尿細管上皮好塩基性変化，精巣において精細管萎縮，精巣上体において管腔内の剥離細胞残渣がみられたが，これらの変化は対照群でも通常観察される変化であることから，偶発的変化と判断される．

2)　投与期間終了時雌

1000 mg/kg群では，肝臓において限局性肝細胞壊死，微小肉芽腫および胆管増生，下垂体においてラトケ嚢遺残がみられたが，これらの変化は対照群でも通常観察される変化であることから，偶発的変化と判断される．

考察

窒化ケイ素を雌雄ラットに28日間経口投与し，その毒性について検討した．

死亡および瀕死例は，いずれの群にも認められなかった．一般状態観察において，いずれの群にも異常はみられなかった．体重，摂餌量および摂水量には，投与に起因する変化はみられなかった．尿検査，血液学検査および血液生化学検査成績には，投与に起因する変化はみられなかった．剖検所見，器官重量および病理組織学検査成績には，投与に起因する変化はみられなかった．

以上のことから，窒化ケイ素は雌雄とも1000 mg/kg投与しても毒性学的影響を生じないと判断される．したがって，当試験条件下における窒化ケイ素の毒性学的無影響量は，雌雄とも1000 mg/kg/dayと考えられる．

連絡先
試験責任者：古橋忠和
試験担当者：長瀬孝彦，内藤一嘉，藤村高志，岡田雅昭，木村　均，吉島賢一
(株)日本バイオリサーチセンター羽島研究所
〒501-6251　岐阜県羽島市福寿町間島6-104
Tel 058-392-6222Fax 058-392-1284

Correspondence
Authors:Tadakazu Furuhashi(Study director)
Takahiko Nagase, Kazuyoshi Naito, Takashi Fujimura, Masaaki Okada, Hitoshi Kimura, Ken-ichi Yoshijima
Nihon Bioresearch Inc.
6-104, Majima, Fukuju-cho, Hashima, Gifu, 501-6251, Japan
Tel +81-58-392-6222