2,2'-メチレンビス(6-tert-ブチル-p-クレゾール)の

ラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of

2,2'-Methylenebis(6-tert-butyl-p-cresol) in Rats

要　約

2,2'-メチレンビス(6-tert-ブチル-p-クレゾール)は，ゴムやプラスチックに酸化防止剤として使用されている物質の一つで，経口投与によるLD５０値は5000 mg/kgを上回ると報告されている１）．本物質の混餌投与による12週間の毒性試験の報告２）はあるが，強制経口投与に関する報告はみあたらない．

今回， OECDによる既存化学物質の安全性点検に係わる毒性試験の一環として，2,2'-メチレンビス(6-tert-ブチル-p-クレゾール)の0(対照)，50，200および800 mg/kg/dayを1群雌雄各6匹のCrj:CD(SD系)ラットに28日間反復経口投与する毒性試験を実施し，以下の結果を得た．なお，対照群および800 mg/kg群にはそれぞれ雌雄各6匹の14日間回復群も設けた．

投与期間および回復期間を通して，雌雄いずれの群にも死亡はなく，一般状態の観察，体重，摂餌量，尿検査および血液生化学検査においても変化はみられなかった．

血液学検査では，プロトロンビン時間および活性化部分トロンボプラスチン時間の延長または延長傾向が 50 mg/kg以上の群にみられた．

病理学検査では，肝臓重量の増加または増加傾向が 50 mg/kg以上の群でみられ，組織学的に肝小葉中心性の肝細胞の軽度の肥大が200 mg/kg以上の群でみられた．精巣では精子停滞およびstep 19の精子細胞の変性が50 mg/kg以上の群に，セルトリ細胞の空胞化が200 mg/kg以上の群でみられた．また，200 mg/kg以上の群で副腎重量の増加がみられた．上記の変化は，精巣の変化を除いていずれも回復するかその傾向を示した．しかし，精巣については，回復期間終了時に巨細胞の形成や精上皮細胞の減少などが 800 mg/kg群に新たに出現し，より重篤な変化を呈した．

以上の結果より，本試験条件下における無影響量は 50 mg/kg/day未満と考えられた．

方　法

1.　被験物質および投与液の調製

2,2'-メチレンビス(6-tert-ブチル-p-クレゾール)(純度98%以上，Lot No.40401，住友化学工業(株))は，水に不溶，アセトン，ヘキサン，シクロヘキサン，スチレンモノマーおよびメタノールに可溶の白色結晶性粉末である．入手後の被験物質は室温，遮光下で保管し，投与終了後に(株)パナファーム・ラボラトリーズにて分析を行って試験期間中安定であったことを確認した．媒体にはアラビアゴム(和光純薬工業(株)，Lot No. PTG0424)の5%水溶液を使用し，これに被験物質を0.5，2および8 w/v%濃度になるように懸濁して投与液を調製した．調製した投与液は室温，遮光下で保管した．なお，初回調製時に，投与液の濃度を測定し，設定値の±10%以内にあることを確認した．また，投与開始前に，本調製法による0.1，1および10 w/v%懸濁液が室温，遮光下で調製後8日間安定であり，かつ均一性についても問題ないことを確認した．

2.　使用動物および飼育条件

5週齢のSprague-Dawley系ラット(Crj:CD，日本チャールス・リバー(株))を雌雄各45匹購入し，8日間の検疫馴化を行ったのち，雌雄各36匹を選んで6週齢で試験に使用した．投与開始時の体重は，雄が208.6〜234.5 g，雌が142.4〜163.8 gであった．動物は，温度24±2℃，湿度55±10%，照明時間7時〜19時および換気回数13回/時に設定したバリアーシステム飼育室でステンレススチール製ハンガーケージに，検疫馴化期間中は1ケージ当たり3匹ずつ，群分け後は個別に収容して，高圧蒸気滅菌処理した固型飼料(MF，オリエンタル酵母工業(株))および次亜塩素酸ナトリウムを添加(約2 ppm)した水を自由に摂取させた．

3.　投与量，投与方法，試験群構成および群分け

投与量は， 2週間反復投与による予備試験(投与量:0，250，500および1000 mg/kg/day)の結果から設定した．すなわち，当該試験において雌のすべての被験物質投与群で，総コレステロールおよびリン脂質の高値，雌の500 mg/kg以上の群ではグルコースの低値が認められ，雌の1000 mg/kg投与群ではカリウムの高値が認められた．また，雌雄のすべての被験物質投与群で，肝臓重量の増加が認められた．したがって，本試験の投与量は明らかな毒性が発現すると考えられる800 mg/kg/dayを高用量とし，以下公比4で除して200および50 mg/kg/dayを中間および低用量にそれぞれ設定した．

投与経路は経口とし，胃管を用いた強制投与を 1日1回，28日間反復して行った．投与容量は10 ml/kgとし，個体ごとに最新の体重を基に算出した．

試験群は，上記 3用量に，5%アラビアゴム水溶液を投与する対照を加えて計4群とした．1群当たりの動物数は，投与期間終了時の剖検例として各群とも雌雄各6匹，さらに，対照群および800 mg/kg群には14日間の回復期間終了時の剖検例として雌雄各6匹を設けた．群分けは，投与開始前日の体重を基に層別連続無作為化法で行った．

4.　検査項目

1)　一般状態の観察，体重および摂餌量の測定

投与期間中は毎日投与前および投与後の計 2回，回復期間中は毎日午前および午後の計2回，一般状態および死亡の有無を観察した．また，体重および摂餌量を投与期間および回復期間を通して週2回の割合で測定した．

2)　尿検査

投与 4週目および回復2週目に，代謝ケージにて絶食，給水下で8時から12時までの間に採取した新鮮尿を用いて，比色試験紙(プレテスト8 a，和光純薬工業(株))によりpH，蛋白質，ブドウ糖，ケトン体，ビリルビン，潜血およびウロビリノーゲンを検査した．さらに，新鮮尿を1500回転/分で5分間遠心分離し，得られた尿沈渣について鏡検した．また，新鮮尿採取後に給餌，給水下で採取した24時間蓄積尿を用いて，尿量，色調，浸透圧(氷点降下法；OSMOMETER OM801，VOGEL社)および比重(屈折率法；尿屈折計，(株)アタゴ)を測定した．

3)　血液学検査

投与期間終了時および回復期間終了時に，動物を 18時間以上絶食させたのち，ペントバルビタール・ナトリウム麻酔下に開腹し，腹部大静脈から採血を行った．採取した血液の一部はEDTA-2Kで処理し，多項目自動血球計数装置(Sysmex CC-780，東亜医用電子(株))により白血球数(電気抵抗検出方式)，赤血球数(電気抵抗検出方式)，ヘモグロビン量(オキシヘモグロビン法)，ヘマトクリット値(血球パルス波高値検出方式)および血小板数(電気抵抗検出方式)を測定し，これらを基に平均赤血球容積(MCV)，平均赤血球血色素量(MCH)および平均赤血球血色素濃度(MCHC)を算出した．また，血液の一部は塗抹標本とし，May-Grnwald-Giemsa染色を施して白血球百分比を視算した．さらに，3.8%クエン酸ナトリウム加血液を3000回転/分で15分間遠心分離し，得られた血漿を用いて全自動血液凝固測定装置(Sysmex CA-5000，東亜医用電子(株))により，プロトロンビン時間(散乱光検出方式)および活性化部分トロンボプラスチン時間(散乱光検出方式)を測定した．

4)　血液生化学検査

血液学検査に引き続き採取した血液を室温で約 60分間放置後，3000回転/分で10分間遠心分離し，得られた血清を用いて自動分析装置(736-10，(株)日立製作所)により，総蛋白質(ビウレット法)，アルブミン(BCG法)，A/G比(総蛋白質およびアルブミンより算出)，総ビリルビン(アルカリアゾビリルビン法)，GOT(Karmen法)，GPT(Wrblewski-La Due法)，γ-グルタミルトランスペプチダーゼ(L-γ-グルタミル-DBHA基質法)，アルカリ性フォスファターゼ(p-ニトロフェニルリン酸基質法)，総コレステロール(COD-DAOS法)，トリグリセライド(GPO-DAOS法・グリセリン消去法)，リン脂質(酵素法・DAOS発色法)，グルコース(グルコキナーゼ・G-6-PDH法)，尿素窒素(ウレアーゼ-GlDH法)，クレアチニン(Jaff法)，無機リン(モリブデン酸直接法)およびカルシウム(OCPC法)を測定した．また，電解質分析装置(PVA-αIII，(株)アナリティカル・インスツルメンツ)によりナトリウム(電極法)，カリウム(電極法)およびクロール(電量滴定法)を測定した．

5)　器官重量の測定，剖検および病理組織学検査

採血終了後に，外側腸骨動脈を切断して放血死させ，剖検した．剖検時に脳，心臓，肺 (気管支を含む)，胸腺，肝臓，脾臓，腎臓，副腎，精巣および卵巣を摘出して器官重量(絶対重量)を測定するとともに，剖検日の体重を基に体重比器官重量(相対重量)を算出した．これらの器官に加え，下垂体，脊髄，眼球，甲状腺(上皮小体を含む)，膵臓，胃，膀胱，大腿骨(骨髄を含む)および肉眼的異常部位を採取して10%中性緩衝ホルマリン溶液(眼球はグルタールアルデヒド溶液，精巣はブアン液で前固定)で固定した．

投与期間終了時の対照群および高用量群の脾臓，心臓，腎臓，副腎については，常法に従ってパラフィン切片を作製し，ヘマトキシリン・エオジン (HE)染色を施して光学顕微鏡下で観察した．肝臓および精巣については投与期間および回復期間終了時の全例の検査を同様に行った．

5.　統計処理

体重，摂餌量，尿検査 (定性反応は除く)，血液学検査，血液生化学検査，器官重量および体重比器官重量について，各群ごとに平均値と標準偏差を求め，Bartlett法により分散の均一性を検定した．分散が均一な場合は一元配置型の分散分析を行い，この解析で群間に有意差が認められた場合はDunnett法により各群の一対比較検定を行った．分散が均一でない場合はKruskal-Wallis法によって順位検定を行い，この検定で群間に有意差が認められた場合はDunnett型の一対比較検定を行った．上述の分散分析あるいは Kruskal-Wallis法による順位検定で群間に有意差が認められなかった場合は，各群間の多重比較は行わなかった．なお，いずれの場合も有意水準は5%とした．

結　果

1.　一般状態

投与期間および回復期間を通して，雌雄のいずれの試験群にも一般状態に変化はなかった．

2.　体重(Fig.1)および摂餌量

体重では，投与期間および回復期間を通して，全被験物質投与群が対照群と同様な推移を示した．摂餌量では， 800 mg/kg群の雌で投与初期に一過性の減少がみられ，後期に一過性の増加がみられた．50 mg/kg群の雌では，投与期間の後期に一過性の増加がみられたが，軽微な変動であり，毒性学的意義はないものと考えられた．

3.　尿検査(Table 1)，血液学検査(Table 2)および血液生化学検査(Table 3)

尿検査では，投与 4週目で雌雄ともにいずれの被験物質投与群にも変化はみられなかった．回復2週目では，800 mg/kg群の雌で尿浸透圧および尿比重の軽微な増加がみられた．同群の雄では，対照群との差はみられなかった．

血液学検査では，投与期間終了時に 50 mg/kg群の雄でヘモグロビンの軽微な減少が，800 mg/kg群の雄で血小板数の軽微な増加がみられた．また，プロトロンビン時間および活性化部分トロンボプラスチン時間の延長または延長傾向が，雄では50 mg/kg以上の群に，雌では200 mg/kg以上の群にみられ，いずれも用量が高くなるにつれて延長する傾向にあった．回復期間終了時の検査では，800 mg/kg群の雄でMCVの軽微な減少が，雌で好酸球百分比の軽微な増加がみられたのみであった．

血液生化学検査では，投与期間終了時に雄の 50 mg/kg以上および雌の200 mg/kg以上の群で総蛋白質の増加または増加傾向がみられ，雄の800 mg/kgおよび雌の200 mg/kg以上の群でアルブミンの増加または増加傾向がみられたが，いずれも極めて軽微な変動であることから，生物学的意義はないと判断した．また，800 mg/kg群の雌で軽微なGOTの減少および尿素窒素の減少がみられた．回復期間終了時には，800 mg/kg群の雄で軽微な総蛋白質の増加およびγ−グルタミルトランスペプチダーゼの減少がみられた．

4.　器官重量(Table 4)

投与期間終了時には，雌雄の全被験物質投与群で肝臓の絶対および相対重量の増加または増加傾向がみられた．また， 200 mg/kg群の雌で副腎の相対重量の増加がみられ，絶対重量でも増加傾向がみられた．さらに，800 mg/kg群の雌でも副腎の絶対および相対重量の増加傾向がみられた．このほか，雄の50 mg/kg以上の群で肺の相対重量の減少または減少傾向がみられたが，軽微な変動であった．

回復期間終了時には，雌雄の 800 mg/kg群で肝臓の絶対および相対重量の増加がみられたが，その程度は投与期間終了時に比べて小さかった．また，雄の800 mg/kg群で脳の絶対重量の軽微な減少がみられ，雌の800 mg/kg群で腎臓の絶対および相対重量の軽微な増加がみられた．

5.　剖検および病理組織学検査(Table 5)

剖検では，投与期間終了時には雌雄のいずれの群にも変化はみられなかった．回復期間終了時には，偶発的変化として， 800 mg/kg群の雄1例に精巣上体の黄白色結節がみられた．

病理組織学検査では，投与期間終了時に 800 mg/kg群の雄1例および雌2例ならびに200 mg/kg群の雌雄各1例の肝臓に小葉中心性の肝細胞の軽度の肥大がみられた．また，雄では50 mg/kg以上の群の全例に精巣の精子停滞が，50 mg/kg群の3例および200 mg/kg以上の群の全例にstep 19の精子細胞の変性およびセルトリ細胞の空胞化がみられ，用量が高くなるほど病変の程度が強かった．回復期間終了時には，雄では800 mg/kg群の5例にセルトリ細胞の空胞化，精子停滞およびstep 19の精子細胞の変性が引き続きみられ，新たに軽度ないし中等度の巨細胞形成，精子細胞の核の空胞化あるいは軽度の精上皮細胞の減少を示す例もあった．さらに，他の1例には重度の巨細胞の形成および精上皮細胞の減少および軽度の精子細胞の核の空胞化がみられた．なお，投与期間終了時にみられた肝臓の変化は，回復期間終了時にはみられなかった．

考　察

一般状態では，雌雄のいずれの試験群にも変化はみられず，体重も全被験物質投与群が対照群と同様な推移を示し，投与の影響はみられなかった．摂餌量では， 200 mg/kg群の雄および800 mg/kg群の雌に減少または増加がみられたが，一過性の軽微な変動であり，また一定の傾向もないことから，毒性学的意義はないものと考えられた．

尿検査では，投与 4週目の検査で雌雄のいずれにも変化はみられなかった．

血液学検査では，投与期間終了時の検査でプロトロンビン時間および活性化部分トロンボプラスチン時間の延長または延長傾向が，雄では 50 mg/kg以上の群に，雌では200 mg/kg以上の群にみられ，いずれも用量が高くなるにつれて程度が強くなる傾向にあった．本被験物質の混餌投与による試験２）でも，プロトロンビン時間および活性化部分トロンボプラスチン時間の延長がみられており，本被験物質の凝固系への影響が窺われた．

血液生化学検査では，投与 4週目の検査で雌雄のいずれにも変化はみられなかった．

病理学検査では，投与期間終了時に全被験物質投与群の雌雄で肝臓の絶対および相対重量の増加あるいは増加傾向がみられ，組織学的には雌雄の 800 mg/kg群および200 mg/kg群の少数例に肝小葉中心性の軽度の肝細胞肥大がみられた．また，精巣では，投与期間終了時に精子停滞およびStep 19の精子細胞の変性が50 mg/kg以上の群に，セルトリ細胞の空胞化が200 mg/kg以上の群にみられ，これらの変化の程度は800 mg/kg群で強かった．肝臓重量の増加は，本被験物質の混餌投与による試験１）でもみられており，また本被験物質の類似物質である2,2'-メチレンビス(4-エチル-6-tert-ブチルフェノール)をラットに4週間混餌投与すると，肝臓の相対重量が増加し，薬物代謝酵素の一つであるNADPH cytochrome c reductaseが増加することが知られている３）ことから，本試験の場合もこれと同様の現象である可能性が示唆された．精巣に対する影響は，本被験物質の混餌投与による試験１）でもみられているが，本試験における変化の程度はやや弱いものであった．また，投与期間終了時には，雌の200 mg/kg以上の群で副腎の絶対および相対重量の増加または増加傾向がみられたが，組織学的変化はみられず，回復期間終了時には重量の変動もなかったことから，毒性学的には重篤な変化とは思われなかった．

回復期間終了時には，これらの変化は，精巣の変化を除いていずれも回復するかその傾向を示しており，いずれも可逆性の変化と考えられた．精巣は，回復期間終了時には 800 mg/kg群で精細管の荒廃が進行し，巨細胞の形成，精子細胞の核の空胞化あるいは精上皮細胞の減少を示す例もあり，より重篤な形態学的変化を呈した．

上記のほか，投与期間終了時の変化として，血液学的検査で 50 mg/kg群の雄にヘモグロビンの軽微な減少が，800 mg/kg群の雄に血小板数の軽微な増加がみられ，血液生化学的検査で800 mg/kg群の雌にGOTの減少および尿素窒素の減少がみられたが，極めて軽微な変化であること，片性のみの変化であることあるいは関連する他のパラメータに変化がみられないことから，被験物質投与による変化とは考えられなかった．また，回復2週目あるいは回復期間終了時では，尿検査，血液学検査，血液生化学検査，剖検および器官重量測定において軽微な変動がみられたが，投与4週目あるいは投与期間終了時の検査では変化はみられないことや関連する他のパラメーターに変化がないことから，毒性学的意義のない変化と思われた．

以上のように，本試験における毒性は，既に実施された混餌投与による毒性試験の結果とほぼ同様であった．また，本試験条件下における無影響量は， 50mg/kg群において凝固時間の延長または延長傾向，肝臓重量の増加または増加傾向ならびに精巣に器質的変化がみられたことから，50mg/kg/day未満と考えられた．

文　献

1)A. Takagi, et al. J. Toxicol. Sci., 19, 77(1994).
2)O. Takahashi, et al. Toxicol. Lett., 7, 405(1981).
3)A. Takagi, et al. J. Toxicol. Sci., 18, 49(1993).

連絡先
試験責任者：一鬼　勉
試験担当者：大塚辰雄，古川浩美，幸　邦憲，
永井憲児，浜村政夫，鍬先惠美子，
津崎慎二
(株)パナファーム・ラボラトリーズ　安全性研究所
〒869-04　熊本県宇土市栗崎町1285
Tel 0964-23-5111Fax 0964-23-2282

Correspondence
Authors:Tsutomu Ichiki(Study director)
Tatsuo Otsuka, Hiromi Furukawa, Kuninori Yuki,
Kenji Nagai, Masao Hamamura, Emiko Kuwasaki,
Shinji Tsusaki
Safety Assessment Laboratory, Panapharm Laboratories Co., Ltd.
1285 Kurisaki-machi, Uto-shi, Kumamoto, 869-04, Japan
Tel +81-964-23-5111Fax +81-964-23-2282