1,2-ビス(2-クロロエトキシ)エタンのラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test
of 1,2-Bis(2-chloroethoxy)ethane in Rats

要約

1,2-ビス(2-クロロエトキシ)エタンの28日間反復投与毒性試験を雌雄のCD(SD)IGS系ラット(SPF)を用いて実施した．

1群雌雄各5匹のラットからなる4試験群を設定し，さらに対照群および高用量群には雌雄各5匹のラットを追加して回復群を設定した．

被験物質をコーンオイルに溶解して，0，50，100および200 mg/kgに相当する量を毎日1回，28日間(4週間)反復経口投与し，一般状態の観察，体重および摂餌量測定，機能観察総合検査(FOB)，血液学検査，血液凝固能検査，血液生化学検査，尿検査，器官重量測定および病理学検査を行った．なお，回復期間は2週間とし，機能観察総合検査(FOB)を除いて投与終了時と同様の検査を実施した．

投与期間中に，200 mg/kg群の雄の1例が死亡し，投与期間終了時の投与後に1例を切迫解剖した．

一般状態では，流涎が各投与群で観察されたが，回復期間で消失した．これは被験物質投与による条件反射と考えられた．また，自発運動低下，削痩，立毛，被毛の汚れおよび異常呼吸音が200 mg/kg群の雄の死亡あるいは切迫解剖した動物に観察された．

機能観察総合検査の症状観察では，投与群で流涎が観察されたが被験物質の投与に伴う直接的な影響であり，神経毒性を示唆する変化とは考えられなかった．

体重，摂餌量，飼料効率，血液学検査，血液凝固能検査および尿検査の結果では被験物質の影響と考えられる変化は認められなかった．

血液生化学検査において200 mg/kg群の雄でALT活性およびカリウム濃度が高値，ナトリウム濃度が低値を示し，被験物質の影響と考えられた．

器官重量測定では，100および200 mg/kg群の雌の肝臓相対重量が高値を示し，被験物質の影響と考えられた．

病理組織学検査では，200 mg/kg群の雌雄の心臓に心筋細胞の変性・壊死ならびにこれに対する細胞反応が認められたが，回復傾向を有する変化であった．

以上のように，雄では200 mg/kg群で死亡例がみられ，心臓に心筋細胞の変性・壊死が観察された．雌では100 mg/kg群で肝臓相対重量の高値が認められた．したがって，本試験条件下における1,2-ビス(2-クロロエトキシ)エタンのラットに対する無影響量は，雄で100 mg/kg/day，雌で50 mg/kg/dayと判断された．

方法

1．被験物質および投与液の調製

1,2-ビス(2-クロロエトキシ)エタン[丸善ケミカル(東京)，Lot No. BB16，純度99.7 %]は常温で安定な無色透明液体の化合物である．投与終了後，残余被験物質を提供元で再分析し，被験物質が試験期間中安定であったことを確認した．

投与液は被験物質をコーンオイル(Lot No. V2P1660，ナカライテスク)に溶解して10，20および40 mg/mLの濃度となるように調製した．なお，コーンオイル中の1,2-ビス(2-クロロエトキシ)エタンは冷蔵保存条件下で7日間安定であることから，投与液の調製は毎週1回実施し，1日分ずつ小分けして投与まで冷蔵庫に保管した．全ての試験群の投与液について適切に調製されていることを確認するため，初回および最終調製時に各投与液の一部を分取し，被験物質濃度を測定した．その結果，初回調製時は設定濃度の103.1〜107.6 %および最終調製時は102.9〜109.7 %であり，適切に調製されていることが確認された．

2．動物および飼育方法

生後4週齢のCrj:CD(SD)IGS系ラット(SPF)雌雄各42匹を日本チャールス・リバーから購入し，検収後9日間，試験環境に馴化させた後，体重増加が順調で一般状態に異常を認めなかった雌雄各30匹(計60匹)を選び，5週齢で投与を開始した．動物は群分け当日の体重に基づいて層別化し，各群の平均体重が均等となるように各群に割り付けた．投与開始時の体重は雄で148〜170 g，雌で124〜138 gであった．試験群は0，50，100および200 mg/kgの4群とし，1群雌雄各5匹を用い，0および200 mg/kg群に雌雄各5匹を追加して回復群を設けた．

動物は，温度21.9〜23.9℃，湿度52〜70 %，換気回数1時間20回，照明12時間(午前7時点灯，午後7時消灯)に設定されたバリアシステム飼育室で飼育した．アルミ製前面・床ステンレス網目飼育ケージに動物を1匹ずつ収容し，オリエンタル酵母工業製造の放射線滅菌したラット，マウス飼料CRF-1(Lot No. 020802，021105)および水道水を自由に摂取させた．飼育ケージは隔週1回，給餌器は週1回取り換えた．

3．投与量の設定および投与方法

投与量設定のため雌雄とも0，30，75および150 mg/kgの4用量で2週間反復投与試験を実施した結果，150 mg/kg群の雌雄において自発運動低下および流涎が観察された．また，150 mg/kg群の雄で肝臓の絶対重量が高値傾向および相対重量が高値を示した．雌では腎臓相対重量が高値を示した．しかし，いずれも十分な毒性影響の発現ではなかった．そこで0，200，300および500 mg/kgの4用量で再度1週間の投与予備試験を実施した．その結果，500 mg/kg群の雌雄の全例が死亡した．300 mg/kg群の雌雄においては自発運動低下および流涎が観察され，雌の3例中1例が死亡した．また，雌雄とも体重増加量が対照群に比較して低値を示した．200 mg/kg群の雌雄においては自発運動低下および流涎が観察されたが死亡例はみられなかった．したがって，28日間反復投与毒性試験では被験物質の毒性影響を確認するために最高用量を200 mg/kgとし，以下公比2で除して中用量を100 mg/kg，低用量を50 mg/kgと設定した．投与液量は体重100 g当たり0.5 mLとし，個体別に測定した体重に基づいて投与液量を算出し，1日1回胃ゾンデを用いて強制経口投与した．対照群にはコーンオイルのみを同様に投与した．なお，回復期間は14日間とした．

4．観察および検査

1)　一般状態の観察

全動物を投与期間中は投与前および投与後1時間以内，回復期間は午前および午後に観察し，中毒症状の有無や行動異常を記録した．

2)　体重

投与開始日，投与3，7，10，14，17，21，24および27日，回復3，7，10および13日に測定した．

3)　摂餌量

給餌量および残量を投与開始日，投与7，14，21および27日，回復7および13日に測定し，平均摂餌量(g/day)および飼料効率(%)を算出した．

4)　機能観察総合検査(FOB)

回復群の動物を除く各群5匹の動物について盲検法で行った．以下のFOBの内，詳細な症状観察は投与開始前に1回および投与開始後は週1回行った．種々の刺激に対する運動感覚反応の観察，握力測定(前肢および後肢)，着地開足幅測定および自発運動測定は投与開始前および投与終了日に行った．なお，投与期間中は投与後1時間に検査を行った．

5)　血液学検査

投与期間終了時および回復期間終了時の計2回実施した．採血するに当たり，動物は約16時間絶食させた．動物をエーテルで麻酔して開腹し，腹部大動脈から採血した．

採取した血液の一部にEDTA-2 Kを添加し，白血球数(WBC:フローサイトメトリー)，赤血球数(RBC:暗視野板法)，ヘモグロビン量(HGB:シアンメトヘモグロビン法)，ヘマトクリット値(HCT:RBC，MCVより算出)，平均赤血球容積(MCV:暗視野板法)，平均赤血球血色素量(MCH:HGB，RBCより算出)，平均赤血球血色素濃度(MCHC:HGB，HCTより算出)，血小板数(PLT:暗視野板法)，白血球百分率(フローサイトメトリー)および網赤血球率(Reticulocyte:RNA染色法)を総合血液学検査装置ADVIA120(バイエル社)を用いて測定した．さらに，3.13 %クエン酸ナトリウム水溶液添加血液の血漿を用いて，プロトロンビン時間(PT)，活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)およびフィブリノーゲン量(Fibrinogen)を全自動血液凝固線溶測定装置STA Compact(ロシュ社)を用いて粘度変化検知方式により測定した．

6)　血液生化学検査

血液学検査に引き続き採取した血液を静置後，遠心分離して得られた血清を用いて，総蛋白(T.protein:Biuret法)，アルブミン(Albumin:BCG法)，A/G比(A/G:総蛋白およびアルブミンより算出)，血糖(Glucose: HK-G-6-PDH法)，中性脂肪(Triglyceride:GK-GPO遊離グリセロール消去法)，総コレステロール(T.cholesterol:コレステロールオキシダーゼHDAOS法)，尿素窒素(BUN:ウレアーゼGLDH法)，クレアチニン(Creatinine:酵素法)，総ビリルビン(T.bilirubin:バナジン酸酸化法)，アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST:酵素-UV法)，アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT:酵素-UV法)，アルカリホスファターゼ(ALP:P-ニトロフェニルリン酸基質法)，γ-グルタミルトランスペプチターゼ(γ-GTP:L-γ-グルタミル3-カルボキシ4NA法)，カルシウム(Calcium:MXB法)および無機リン(I.phosphorus:PNP-XDH法)を多項目生化学自動分析装置日立7170(日立製作所)により測定した．電解質のナトリウム(Sodium:イオン選択電極法)，カリウム(Potassium:イオン選択電極法)および塩素(Chloride:イオン選択電極法)を電解質測定装置EA06R(エイアンドティー)を用いて測定した．

7)　尿検査

投与期間終了週および回復期間終了週に検査を実施した．すなわち，検査動物を代謝ケージに個別に収容し，絶食・絶水の条件下で採尿ケージを用いて一夜尿(午後4時から翌日午前9時まで)を採取した．採尿に先立ち，水道水を20 mL/kgに相当する量を強制経口投与した．N-マルティスティックスSG(バイエル メディカル)と尿分析装置CLINITEK 500(バイエル社)でpH，潜血，ケトン体，糖，蛋白，ビリルビン，ウロビリノーゲンを検査した．また，尿量，色調，尿浸透圧および尿沈渣を検査した．なお，尿浸透圧は，自動浸透圧測定装置OM-6030(アークレイファクトリー)を用いて氷点降下法で測定した．また，尿を1500 r.p.m.で5分間遠心し，残渣を用いてステルンハイマー変法による染色を施し，尿沈渣標本を作製して鏡検した．

8)　病理学検査

投与期間終了時および回復期間終了時に動物をエーテル麻酔し，放血後解剖を実施した．死亡動物は発見後ただちに解剖した．解剖では動物の体表，体腔および諸器官について観察し，すべての肉眼異常(部位，大きさ，硬さなど)を記録した．

器官重量は心臓，肝臓，脾臓，腎臓，副腎，精巣，卵巣，脳，胸腺，精巣上体および子宮について測定した．器官重量/体重比(相対重量)は解剖当日の測定体重および器官重量から算出した．また，リンパ節(腸間膜，下顎)骨髄(大腿骨)，胸腺，気管，肺(気管支を含む)，心臓，甲状腺，下顎腺，胃，十二指腸，空腸，回腸(パイエル氏板を含む)，盲腸，結腸，直腸，膵臓，肝臓，脾臓，腎臓，副腎，膀胱，精嚢，前立腺，精巣，精巣上体，卵巣，子宮，腟，脳，眼球(視神経を含む)，下垂体，脊髄(頸部，胸部，腰部)，骨格筋(大腿部)および坐骨神経を10 %中性緩衝ホルマリン液で固定した．なお，精巣はホルマリン酢酸液(FA液)で前固定した後，10 %中性緩衝ホルマリン液で固定した．病理組織学検査は対照群および最高用量群の上記器官および組織について実施した．また，200 mg/kg群の心臓で被験物質の影響と考えられる変化が認められたため，他の用量群についても実施した．組織標本は，常法に従ってパラフィン包埋，薄切後，ヘマトキシリン・エオジン染色を施した．鏡検では，病変の種類および程度を含む各所見について記録した．

5．統計解析

各試験群の体重，摂餌量，飼料効率，FOB検査値(握力，着地開足幅，自発運動量，立ち上がり回数，脱糞回数，排尿回数)，血液学検査値，血液凝固能検査値，血液生化学検査値，尿検査値(尿量および浸透圧)，器官重量および器官重量/体重比は，最初にBartlettの等分散検定1)を実施した．等分散の場合はDunnettの多重比較検定2)で対照群と各投与群間の有意差を検定した．Bartlettの等分散検定で不等分散の場合はSteelの検定3)で対照群と各投与群間の有意差を検定した．上記定量値の有意水準は5 %および1 %の両側検定で実施した．また，病理学検査結果の検定はFisherの正確検定法4)を用いた．

結果

1．一般状態

投与期間中，流涎が100および200 mg/kg群の雌雄で投与1日以降に，また，50 mg/kg群の雄で投与10日以降，雌で投与12日以降に観察された．発生は50，100および200 mg/kg群の雄で2，4および10例，雌で1，4および10例であった．200 mg/kg群の雄の1例が投与後9日に死亡し，投与期間終了時の投与後に1例が切迫解剖された．死亡動物では自発性運動低下が，切迫解剖された動物では自発性運動低下，削痩，立毛，被毛の汚れおよび異常呼吸音が観察された．

2．体重(Fig. 1)

各投与群の雌雄において差は認められなかった．

3．摂餌量

各投与群の雌雄で差が認められなかった．飼料効率では，200 mg/kg群の雌が投与7日に低値を示したが，投与14日以降は差がみられなかった．

4．機能観察総合検査(FOB)

投与2および3週の検査において200 mg/kg群の雄で軽度な流涎の発生数が高値を示した．なお，種々の刺激に対する運動感覚反応の観察，握力測定(前肢および後肢)，着地開足幅および自発運動量に変化は認められなかった．

5．血液学検査(Table 1)

投与期間終了時の200 mg/kg群の雄ではヘマトクリット値が高値を，MCHCが低値を示した．また，雌雄で網赤血球率が低値を示した．

回復期間終了時の200 mg/kg群の雄でMCVおよび血小板数が高値を示した．雌で白血球数および好中球比率が低値を，リンパ球比率が高値を示した．しかし，いずれも軽微な変化であった．

6．血液生化学検査(Table 2)

投与期間終了時の200 mg/kg群の雄でALT活性およびカリウム濃度が高値，ナトリウム濃度が低値を示した．

回復期間終了時の200 mg/kg群の雄でALP活性が，雌で血糖がいずれも低値を示した．

7．尿検査(Table 3)

投与期間終了時の100 mg/kg群の雌で尿浸透圧が高値を示したが用量に関連しない変化であった．回復期間終了時の200 mg/kg群の雌で尿浸透圧が低値を示した．

8．器官重量(Table 4)

投与期間終了時の100 mg/kg群の雌で腎臓絶対重量が高値を示したが用量に関連しない変化であった．器官重量/体重比では，100および200 mg/kg群の雌で肝臓相対重量が高値を示した．また，200 mg/kg群の雄で腎臓および精巣相対重量が高値を示した．その他，100 mg/kg群の雌で腎臓相対重量が高値を示したが用量に関連しない変化であった．

9．病理学検査

1)　剖検所見(Table 5)

投与期間終了時:雌雄とも用量に関連した発生を示す所見は認められなかった．しかし，200 mg/kg群で雄の1例に胃の赤色斑点および精嚢の萎縮，雌の1例に腟の結節が認められた．加えて，計画解剖日に切迫解剖した雄の1例では，削痩，胃の黒色斑点，脾臓および肝臓の淡色化が観察された．投与9日に死亡した雄の1例では，肝臓，肺および胸腺における赤色斑点，肝臓の白色斑点，胸部および下顎リンパ節の赤色化が認められた．

回復期間終了時:観察された所見は，いずれも対照群のみの発生あるいは用量と関連のない発生であった．

2)　組織所見(Table 6)

投与期間終了時:200 mg/kg群では雌雄とも心筋細胞の変性・壊死および細胞浸潤が散見された．加えて，雄の1例では線維化も伴っていた．なお，細胞浸潤は，対照群，50および100 mg/kg群ではいずれも軽度であったのに対し，200 mg/kg群の雄では軽度1例，中等度3例，同群の雌では中等度2例，高度1例であった．なお，50および100 mg/kg群では心臓に被験物質投与の影響は認められなかった．

腎臓の尿細管硝子滴が200 mg/kg群の雄のみに3例発生した．当病変は，同週齢の無処置ラット雄に発生するα2u-グロブリンの再吸収に起因したと考えられているいわゆる好酸性小体とその形態学的特徴(弱好酸性，不整形，周囲にハローを形成，細胞質内に占める割合が大きい)および程度に差はなかった．しかし，対照群には認められていないことから200 mg/kg群で好酸性小体が誘発された可能性も否定できない．

切迫解剖した200 mg/kg群の雄の1例では，他の計画解剖動物同様，心臓の中等度の心筋変性および細胞浸潤が観察されたのに加え，肝臓の肝細胞の微小空胞型脂肪化，有糸分裂および好酸性小体，肺の出血およびヘマトイジン結晶沈着，骨髄の赤血球系造血低下，脾臓の白脾髄の萎縮および赤血球系造血低下，下顎リンパ節，腸間膜リンパ節および胸腺のリンパ球の核崩壊，下顎リンパ節のリンパ洞マクロファージの単細胞壊死，十二指腸，空腸および回腸の上皮細胞の空胞変性，膵臓のチモーゲン顆粒減少，腎臓の尿細管硝子滴(好酸性小体)および片側性精巣精細管の単細胞壊死ならびに精巣上体の管内細胞残屑が認められた．

肺のヘマトイジン結晶沈着は限局性で軽度な病変であり，自然発生することが知られている．腎臓の尿細管硝子滴(好酸性小体)も同様に自然発生病変と特徴ならびに程度に差はなかった．精巣精細管の単細胞壊死ならびに精巣上体の管内細胞残屑については片側性の変化であることから偶発的な病変と考えられた．脾臓の白脾髄萎縮，リンパ節および胸腺におけるリンパ球の核崩壊や膵臓のチモーゲン顆粒減少は一般状態の悪化した動物にみられる非特異的変化であったが，十二指腸，空腸および回腸の上皮細胞の空胞変性は本症例のみの発生であり，発現意義は不明であった．

投与終了時の生存動物で肉眼所見の認められた200 mg/kg群の雄の1例では，前胃の水腫，出血，細胞浸潤および扁平上皮過形性，前立腺の単細胞壊死および精嚢の分泌減少が認められたが，体重増加抑制のある動物に認められることのある非特異的，かつ軽度な変化であり，被験物質投与の直接的な影響とは考えられなかった．その他，200 mg/kg群のみに観察された所見は，一部に限局した軽度な自然発生ないし偶発的と考えられる所見であった．

回復期間終了時:200 mg/kg群の雄の1例の心房に軽度な線維化部位が散見されたが，心筋細胞の変性・壊死は観察されず，同群の他の動物には雌雄とも被験物質投与の影響は認められなかった．200 mg/kg群のみに発生した肺のマクロファージ集簇，肝臓の髄外造血および膵臓の腺房細胞の局所萎縮は，いずれも一部に限局した極めて軽度な所見であり，発生個体における系統だった所見ではないことから自然発生ないし偶発的所見と考えられた．その他に観察された所見は，対照群のみの発生，または対照群を含めて200 mg/kg群に発生し対照群の病変と程度に差がない所見であった．

死亡動物:心臓の心筋変性および細胞浸潤，肺のうっ血，出血，水腫およびマクロファージの集簇，肝臓の肝細胞の肥大，好酸性小体，脂肪化および有糸分裂ならびにうっ血，脾臓の白脾髄萎縮，下顎および腸間膜リンパ節の濾胞萎縮，胸部および下顎リンパ節のうっ血，胸腺および膵臓の出血が観察された．

考察

1,2-ビス(2-クロロエトキシ)エタンを50，100および200 mg/kgの用量でCD(SD)IGS系ラットの雌雄に28日間にわたって反復経口投与し，その後，対照群および200 mg/kg群の雌雄各5匹の動物について14日間の回復期間を設けた．

投与期間中に，200 mg/kg群の雄の1例が死亡し，投与期間終了時の投与後に1例を切迫解剖した．

一般状態では，流涎が各投与群で観察され，この所見は回復期間で消失した．

流涎は被験物質投与による条件反射と考えられた．また，自発運動低下，削痩，立毛，被毛の汚れおよび異常呼吸音が200 mg/kg群の雄の死亡あるいは切迫解剖した動物に観察された．

機能観察総合検査の症状観察では投与群で流涎が観察されたが被験物質の投与に伴う直接的な影響であり，神経毒性を示唆する変化とは考えられなかった．

血液生化学検査において200 mg/kg群の雄でALT活性およびカリウム濃度が高値，ナトリウム濃度が低値を示し，被験物質の影響と考えられた．

器官重量測定では100および200 mg/kg群の雌の肝臓相対重量が高値を示し，被験物質の影響と考えられた．なお，200 mg/kg群の雄で腎臓および精巣の相対重量が高値を示したが，この群の体重の低値傾向による二次的変化と考えられた．

病理学検査では，200 mg/kg群の雌雄の心臓に認められた病変は，心筋細胞の変性・壊死およびこれに引き続いて起こる修復反応であった．これらの投与終了時に観察された病変は投与を中止してから14日後には認められず回復傾向を有する変化と考えられた．心筋細胞の変性・壊死病変は散在性にみられたが，発生が1細胞単位であり巣状に起こることはなくマクロファージの食作用により処理可能な程度であった．修復範囲が狭かったために回復期間終了時には病変が認められなかったものと思われる．死亡動物では肺にうっ血，出血および水腫が観察されたが，これは急性心不全による続発性変化であり，死因は呼吸不全と考えられた．その他の臓器にみられた出血およびうっ血も直接的あるいは間接的に心臓の機能不全に起因するものと思われる．また，死亡動物および投与期間終了時の投与後に切迫解剖した動物では，肝臓に肝細胞肥大あるいは有糸分裂など肝細胞への直接的な影響への反応を示す所見が観察されたが，好酸性小体とともにこれらの所見の発現意義は不明である．

以上のように，雄では200 mg/kg群で死亡例がみられ，心臓に心筋細胞の変性・壊死が観察された．雌では100 mg/kg群で肝臓相対重量の高値が認められた．したがって，本試験条件下における1,2-ビス(2-クロロエトキシ)エタンのラットに対する無影響量は，雄で100 mg/kg/day，雌で50 mg/kg/dayと判断された．

文献

1)Snedecor GW, Cochran WG: Analysis of Variance: The Random Effects Model. In “Statistical Methods” 8th ed., Iowa State University Press (1989)pp.237-253.
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4)Hollander W: An exact test for the difference between two success probabilities(Fisher). In “Nonparametric statistical methods” Second(ed.), John Wiley & Sons(1999)pp.473-477.

連絡先
試験責任者：渡　修明
試験担当者：各務　進，常木亜沙子，牧野江梨子，
志賀敦史，大川原一弘
（財）食品農医薬品安全性評価センター
〒437-1213　静岡県磐田郡福田町塩新田字荒浜582-2
Tel 0538-58-1266Fax 0538-58-1393

Correspondence
Authors:Nobuaki Watari(Study director),
Susumu Kakamu, Asako Tuneki,
Eriko Makino, Atusi Shiga,
Kazuhiro Ookawara
Biosafety Research Center, Foods, Drugs and Pesticides(An-pyo Center)
582-2 Shioshinden Arahama, Fukude-cho, Iwata-gun, Shizuoka, 437-1213, Japan
Tel +81-538-58-1266Fax +81-538-58-1393