Ｎ-(アミノエチル)エタノールアミンのラットを用いる
28日間反復経口投与毒性試験
Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of
N-(Aminoethyl)ethanolamine in Rats
要約
既存化学物質の毒性評価の一環として，Ｎ
-(アミノエチル)エタノールアミンの0(注射用水)，60，250および1000 mg/kgをSD系ラットに28日間強制経口投与し，その毒性を検討した．0，250および1000 mg/kg群については，別に14日間の回復群を設けた．
被験物質投与に起因する死亡および一般状態の変化はみられず，体重への影響もみられなかった．
摂餌量では，投与開始初期に一時的な減少が
250 mg/kg群の雄および1000 mg/kg群の雌雄に，尿検査では，蛋白の増加が250 mg/kg群の雌および1000 mg/kg群の雌雄に，比重の上昇が250および1000 mg/kg群の雌に，尿量の減少が1000 mg/kg群の雌に，血液学検査では，ヘモグロビン量の減少が1000 mg/kg群の雌雄に，血液生化学検査では，GOTの上昇が250および1000 mg/kg群の雄に，総コレステロールの減少が1000 mg/kg群の雌に，塩素の減少が1000 mg/kg群の雄にみられた．
病理学検査では，腎臓で重量の増加が
1000 mg/kg群の雌雄にみられ，組織学的には，皮髄境界部における近位尿細管の腫大と両染性小体の沈着が250 mg/kg群の雄および1000 mg/kg群の雌雄にみられた．また，胃において境界縁粘膜の肥厚が250および1000 mg/kg群の雌雄にみられた．他に，副腎で相対重量の減少が1000 mg/kg群の雄にみられたが，組織学的異常は認められなかった．
回復群においては，胃および腎臓を除くほとんどの変化は消失した．胃境界縁では粘膜の肥厚が
1000 mg/kg群の雌雄にみられたが，投与終了時と比べ軽減していた．また，腎臓では再生像と考えられる近位尿細管の好塩基性化が250 mg/kg以上の投与群の雄に認められ，いずれの変化も可逆性のものと考えられた．
以上の結果から，本試験条件下におけるＮ
-(アミノエチル)エタノールアミンの無影響量は雌雄とも60 mg/kg/dayと考えられた．
方法
1. 被験物質および被験液の調製
被験物質Ｎ
-(アミノエチル)エタノールアミンは，分子量104.15，融点-38℃，沸点243.7℃，比重1.0304の液体で，水およびメタノールと極めて良く混和する．本試験にはロット番号092210(日本乳化剤(株)製)，純度99.9%のものを用いた．なお，投与終了後の残余被験物質について分析を行った結果，使用期間中は安定であったことが確認された．投与容量が5 ml/kg体重となるよう，注射用水(日本薬局方)に溶解して高用量群の投与液(20%(w/v))を調製した．中および低用量群の投与液は，20%液を注射用水で段階的に希釈してそれぞれ5および1.2%液とした．0.1〜20%(w/v)液は，室温で1日間および冷蔵(約4℃)・暗所(褐色ガラス瓶)・窒素置換で8日間まで安定であったことから，被験液は最大1週間分を一括して調製し，1日分ずつ褐色ガラス瓶に分注し，窒素置換した上で，冷蔵庫(約4℃)に保存した．また，投与開始前および投与終了週の2回，投与に使用する各濃度液について当施設で濃度を測定した結果，いずれも適正であった．
2. 使用動物および飼育条件
5週齡のCrj:CD(SD)系SPF雌雄ラットを日本チャールス・リバー(株)から購入し，当所で約1週間検疫・馴化飼育した後，体重増加が順調で一般状態に異常を認めなかった雌雄各42匹を選び，6週齡で試験に供した．投与開始日の体重範囲は，雄で191〜219 g(平均値：203.8 g)，雌で154〜183 g(平均値：166.6 g)であった．
動物は，群分け当日の体重に基づいて層別化し，各群の平均体重がほぼ均等となるよう，コンピュータを用いて各群に割り付けた．
動物は，温度
23±3℃，相対湿度50±20%，換気回数1時間当たり11〜13回，照明1日12時間の飼育室で，金属製網ケージに1匹ずつ収容し，固型飼料(放射線滅菌CRF-1，オリエンタル酵母工業(株))および飲料水(水道水)を自由に摂取させ飼育した．
3. 投与量および投与方法
2週間投与による予備試験(投与量：0，15，60，250および1000 mg/kg)の結果，1000 mg/kg群でヘモグロビン量の減少が雄に，腎臓重量の増加が雌にみられ，250 mg/kg以下の投与群では変化は認められなかった．これらの成績から，本試験では1000，250および60 mg/kgの3用量を設定し，これに対照群を加えて計4群を使用した．さらに，対照群，250および1000 mg/kg群では14日間の回復群を設けた．動物数はいずれの群も雌雄各6匹とした．
被験液の投与容量は
5 ml/kg体重とし，金属製胃ゾンデを用いて1日1回28日間強制経口投与した．対照群には溶媒(注射用水)を同様に投与した．
4. 検査項目
1) 一般状態の観察
投与期間中は毎日
2回以上，回復期間中は毎日1回観察した．
2) 体重
投与期間および回復期間を通じ，週
2回の頻度で体重を測定した．
3) 摂餌量測定
投与期間および回復期間を通じ，週
2回の頻度で摂餌量を測定した．
4) 血液学検査
投与期間および回復期間終了の翌日の剖検時に検査を行った．前日から一夜
(約16時間)絶食させた動物をエーテル麻酔下で開腹し，腹大動脈から抗凝固剤(EDTA-2K)を加えた採血ビンに血液を採取し，赤血球数(電気抵抗変化検出法)，ヘモグロビン量(シアンメトヘモグロビン法)，ヘマトクリット値(平均赤血球容積および赤血球数から算出)，平均赤血球容積(電気抵抗変化検出法)，平均赤血球血色素量(ヘモグロビン量および赤血球数から算出)，平均赤血球血色素濃度(ヘモグロビン量およびヘマトクリット値から算出)，血小板数(電気抵抗変化検出法)，白血球数(電気抵抗変化検出法)(以上コールター全自動8項目血球アナライザーT890，(株)日科機)，網赤血球率(Brecher法)および白血球百分率(May-Giemsa鏡検法)を測定した．また，3.8%クエン酸ナトリウムを加えた容器に採取した血液を遠心分離(3000 rpm，10分間)し，得られた血漿を用いてプロトロンビン時間および活性化部分トロンボプラスチン時間(以上クロット法，血液凝固自動測定装置，ACL-100，Instrumentation Laboratory)を測定した．
5) 血液生化学検査
血液学検査のための採血と同時に腹大動脈から採血し，遠心分離
(3000 rpm，10分間)により得られた血清を用いてAlP(Bessey-Lowry法)，総コレステロール(CEH-COD-POD法)，トリグリセライド(GK-GPO-POD法)，リン脂質(PLD-ChOD-POD法)，総ビリルビン(アゾビリルビン法)，血糖(Hexokinase-G6PD法)，尿素窒素(Urease-GLDH法)，クレアチニン(Jaff
法)，ナトリウム，カリウムおよび塩素(イオン選択電極法)，カルシウム(OCPC法)，無機リン(モリブデン酸法)，総蛋白質(Biuret法)，アルブミン(BCG法)およびA/G比(総蛋白質およびアルブミンから算出)を測定した．また，ヘパリンを加えた容器に採血し，遠心分離(3000 rpm，10分間)により得られた血漿を用いてGOT，GPT，LDH(UV-rate法)，γ-GTP(γ-グルタミル-3-カルボキシ-4-ニトロアニリド法)およびChE(DTNB法)(以上いずれも自動分析装置Monarch，Instrumentation Laboratory)を測定した．
6) 尿検査
投与終了時剖検動物は投与第
4週(検査当日の投与後)に，回復群の動物は回復第2週に検査を行った．検査動物を代謝ケージに個別に収容し，絶食・自由摂水下で4時間尿を，次いで自由摂食・自由摂水下でその後の20時間尿を採取した．採取した最初の4時間尿を用いてpH，蛋白質，ケトン体，ブドウ糖，潜血，ビリルビン，ウロビリノーゲン(以上URIFLET7A試験紙，(株)京都第一科学)，色調(肉眼観察)および沈渣(鏡検)を検査した．また，その後に得られた20時間尿を用いて比重(屈折法，アタゴ屈折計，(株)アタゴ)を測定し，4時間尿量および20時間尿量から1日の尿量を算出した．さらに，代謝ケージに収容した状態で，前日からの1日の摂水量を給水瓶を用いて測定した．
7) 剖検および器官重量
上記血液学検査および血液生化学検査のための採血後に放血致死させ，外表異常の有無を観察した後，頭部，胸部および腹部を含む全身の器官・組織について肉眼的に異常の有無を観察した．続いて，以下に示す器官を摘出後，器官重量
(絶対重量)を測定した．また，絶食後の体重および絶対重量から体重100 g当たりの相対重量を算出した．死亡動物は，発見後すみやかに剖検した．
脳，胸腺，心臓，肺
(気管支を含む)，肝臓，脾臓，腎臓，副腎，精巣，卵巣
8) 病理組織学検査
全動物について以下に示す全器官・組織を採取し，リン酸緩衝
10%ホルマリン液(但し，眼球およびハーダー腺は3%グルタルアルデヒド・2.5%ホルマリン液)で固定した．さらに， *印を施した器官・組織についてパラフィンに包埋した．投与終了時剖検動物では，このうち対照群と高用量群は包埋した全ての器官・組織について，中および低用量群は被験物質投与による変化がみられた胃と腎臓についてそれぞれ切片とし，ヘマトキシリン・エオジン(H.E.)染色を施して鏡検した．なお，H.E.染色上，腎臓の近位尿細管に両染性小体の沈着がみられたため，これを同定する目的で高用量群の少数例について鉄，PASおよびシュモール染色を実施した．回復群では，投与終了時剖検動物で被験物質投与による変化がみられた胃と腎臓について全動物を検査した．
脳
*，脊髄*，坐骨神経*，胸大動脈，心臓*，気管*，肺(気管支を含む)*，舌，食道，胃*，十二指腸*，空腸*，回腸，盲腸*，結腸*，直腸*，唾液腺(顎下腺・舌下腺)，肝臓*，膵臓*，下垂体*，甲状腺(上皮小体を含む)*，副腎*，胸腺*，脾臓*，腸間膜リンパ節*，頸部リンパ節*，腎臓*，膀胱*，精巣*，精巣上体*，精嚢，前立腺*，卵巣*，子宮*，腟*，乳腺，皮膚，眼球*，ハーダー腺，骨及び骨髄(胸骨・大腿骨)*，大腿筋，肉眼的異常部位*
5. 統計解析
各検査項目のうち，数値化した成績についてまず
Bartlett法により各群の分散の均一性の検定を行った．その結果，分散が均一の場合には一元配置法による分散分析を行い，群間に有意差が認められたならば，Dunnett法(各群の例数が等しいとき)またはScheff法(各群の例数が異なるとき)を用いて対照群と各投与群との平均値の差の検定を行った．分散が均一でない場合には，Kruskal-Wallisの順位検定を行い，有意であればDunnett型(各群の例数が等しいとき)またはScheff型(各群の例数が異なるとき)を用いて対照群と各投与群との平均順位の差の検定を行った．検定はいずれも両側で，有意水準は5および1%とした1)．
結果
1. 死亡動物および一般状態
いずれの動物にも被験物質投与によると考えられる症状はみられなかった．なお，
1000 mg/kg群の雌1例が投与14日に死亡したが，食道の穿孔および胸水の貯留がみられ，誤投与による死亡であった．
2. 体重(Fig.1)
1) 投与期間
雌雄ともに，各投与群の体重は対照群と同様に推移した．
2) 回復期間
雌雄ともに，各投与群の体重は対照群と同様に推移した．
3. 摂餌量
1) 投与期間
雄では，
250および1000 mg/kg群で，投与4日に対照群を有意に下回った．しかし，その後は対照群と同様に推移した．雌では，1000 mg/kg群で，投与4日に対照群を有意に下回った．しかし，その後は対照群と同様に推移した．
2) 回復期間
雌雄ともに，各投与群の摂餌量は対照群と同様に推移した．
4. 血液学検査(Table 1)
1) 投与終了時
雌雄ともに，
1000 mg/kg群でヘモグロビン量の有意な減少がみられた．
2) 回復終了時
雄では，
250 mg/kg以上の投与群で赤血球数の有意な増加が，1000 mg/kg群で血小板数および白血球数の有意な増加がみられた．雌では，各投与群ともに対照群との間に有意差はみられなかった．
5. 血液生化学検査(Table 2)
1) 投与終了時
雄では，
250 mg/kg以上の投与群でGOTの有意な上昇が，1000 mg/kg群で塩素の有意な低下がみられた．他に，60 mg/kg群でGPTの有意な減少，250 mg/kg群で総コレステロールおよびリン脂質の有意な減少がみられたが，いずれも用量に関連した変化ではなかった．雌では，1000 mg/kgで総コレステロールの有意な減少がみられた．他に，60および250 mg/kg群でカルシウムの有意な減少がみられたが，用量に関連した変化ではなかった．
2) 回復終了時
雄の各投与群では，対照群との間に差はなかった．雌では，
1000 mg/kg群で血糖値の有意な減少がみられた．
6. 尿検査(Table 3)
1) 投与第4週
雄では，
1000 mg/kg群に尿蛋白の増加傾向がみられた．雌では，250 mg/kg以上の投与群に尿蛋白および尿沈渣中のリン酸塩の増加傾向がみられた．また，尿比重の有意な上昇が250 mg/kg以上の投与群に，尿量の有意な減少が1000 mg/kg群にみられた．
2) 回復第2週
雌雄ともに対照群との間に明らかな差は認められなかった．
7. 器官重量(Table 4)
1) 投与終了時剖検例
腎臓で，絶対および相対重量の有意な増加が
1000 mg/kgの雄に，相対重量の有意な増加が1000 mg/kgの雌にみられた．また，副腎で，相対重量の有意な減少が1000 mg/kg群の雄にみられた．
2) 回復終了時剖検例
脾臓で，相対重量の有意な増加が
1000 mg/kg群の雄にみられた．
8. 剖検所見
1) 死亡例
投与期間中に死亡した
1000 mg/kg群の雌1例では，食道の穿孔と胸水(血液様，約1.5 ml)がみられたほか，肝臓に横隔膜ヘルニアがみられた．
2) 投与終了時剖検例
被験物質投与によると考えられる変化はみられなかった．
3) 回復終了時剖検例
被験物質投与によると考えられる変化はみられなかった．
9. 病理組織学検査(Table 5)
1) 死亡例
誤投与により死亡した
1000 mg/kg群の雌1例では，胃境界縁粘膜の軽度な肥厚が同用量群の他の投与終了時剖検例と同様にみられたほか，心臓で限局性の出血，肺で水腫と限局性出血，肝臓でヘルニア結節がみられた．
2) 投与終了時剖検例
被験物質投与によると考えられる変化が胃と腎臓にみられた．
胃：境界縁粘膜のごく軽度から軽度な肥厚が
250mg/kg群の雄3例と雌1例，1000 mg/kg群の雄6例と雌5例にみられた．本所見は，厚みを増した重層扁平上皮層の大きなうねりとして認められ，上皮の変性・壊死あるいは炎症反応を伴うものではなかった．60 mg/kg群では異常は認められなかった．
腎臓：皮髄境界部における近位尿細管のごく軽度から軽度な腫大が
250 mg/kg群の雄3例，1000 mg/kg群の雄6例と雌2例に，同部位における近位尿細管への両染性小体のごく軽度から軽度な沈着が250 mg/kg群の雄1例，1000 mg/kg群の雌雄各3例にみられた．H.E.染色上両染性小体として認められた物質は，鉄，PASおよびシュモール染色のいずれも陰性であり，同定できなかった．
3) 回復終了時剖検例
胃：境界縁粘膜のごく軽度な肥厚が
1000 mg/kg群の雄1例と雌2例にみられた．
腎臓：皮髄境界部における近位尿細管のごく軽度な好塩基性化が
250 mg/kg群の雄2例と1000 mg/kg群の雄5例にみられた．
考察
投与期間中，
1000 mg/kg群の雌1例が誤投与により死亡した以外死亡はみられず，また，一般状態および体重にも被験物質投与による変化は認められなかった．
摂餌量では，
250 mg/kg以上の投与群で投与開始4日に減少がみられたが，一時的な変化で，また，これらの群の体重にも影響がなかったことから，極めて軽度な変化であった．
尿検査では，
250 mg/kg以上の投与群に尿蛋白の増加と比重の上昇がみられ，さらに，1000 mg/kg群では尿量も減少した．腎臓の病理組織学検査の結果では，250 mg/kg以上の投与群の皮髄境界部の近位尿細管に腫大と両染性小体の沈着が認められた．また，1000 mg/kg群では腎重量も増加した．これらのことから，上述の尿所見は，本被験物質の腎臓に対する影響と関連した変化と考えられる．他に，沈渣の観察において，250 mg/kg以上の投与群の雌でリン酸塩がやや多くみられたが，毒性学的意義のないものと考えられた．
血液学検査では，
1000 mg/kg群でヘモグロビン量の減少がみられたが，赤血球数，ヘマトクリット値および赤血球恒数に著変はなく，赤血球に対する影響は軽微なものと考えられた．
血液生化学検査では，
250 mg/kg以上の投与群でGOTの上昇，さらに，1000 mg/kg群では総コレステロールと塩素の減少がみられた．塩素の減少は，腎臓障害に関連した変化と考えられるが，GOTおよび総コレステロールの変化との関連性が考えられる肝臓では，重量，肉眼観察および病理組織学検査においても明らかな変化は認められなかった．
病理学検査では，既に述べた如く，腎臓に変化がみられたが，病変は皮髄境界部の近位尿細管に限局しており，同部位に対する標的性が示唆された．また，
250 mg/kg以上の投与群の胃では，境界縁粘膜の肥厚が観察された．しかし，この変化は境界縁に限局した変化で，本領域と同様に重層扁平上皮を有する他の前胃領域，あるいは固有胃腺を有する腺胃には変化は認められなかった．なお，副腎重量の減少が1000 mg/kg群の雄にのみみられたが，組織学的な変化は認められなかった．
回復群においては，腎臓で，皮髄境界部の近位尿細管の腫大や両染性小体の沈着は認められず，代って好塩基性を示す尿細管がみられた．本所見は，被験物質によって誘発された障害からの修復過程を示す再生像と推定され，変化の可逆性が示唆された．また，胃における境界縁粘膜の肥厚も
1000 mg/kg群に認められたが，投与期間終了時と比べてその頻度は明らかに減じており，可逆性の変化であることが示唆された．さらに,投与期間中あるいは終了時の尿，血液学および血液生化学検査で認められた変化も，回復群では認められなかった．従って，本被験物質によってもたらされた変化はいずれも可逆性のものと判断された．
以上の如く，Ｎ
-(アミノエチル)エタノールアミンをラットに28日間反復経口投与した結果，250 mg/kg以上の投与群で主として腎臓と胃に変化がみられ，一方，60 mg/kg群では変化は認められなかった．これらの結果から，本試験条件下におけるＮ-(アミノエチル)エタノールアミンの無影響量は雌雄とも60 mg/kg/dayと考えられた．
文献
| 1) | S. C. Gad and C. S. Weil, "Principles and Methods of Toxicology," 2, ed. by A. Wallace Hayes, Raven Press, Ltd., New York, 1989, pp. 435-483. |
| 連絡先 |
| 試験責任者： | 岡崎修三 |
| 試験担当者： | 榎並倫宣，中村英明，畠山和久，
田村一利，沼田弘明，勝亦倶慶
|
| (株)ボゾリサーチセンター 御殿場研究所 |
| 〒412 静岡県御殿場市かまど1284 |
| Tel.0550-82-2000 | Fax.0550-82-2379 | |
| Correspondence |
| Authors: | Shuzo Okazaki (Study director)
Tomonori Enami, Hideaki Nakamura,
Kazuhisa Hatayama, Kazutoshi Tamura,
Hiroaki Numata, Tomoyoshi Katsumata |
| Gotemba Laboratory, Bozo Research Center Inc. |
| 1284, Kamado, Gotemba-shi, Shizuoka, 412, Japan |
| Tel.+81-550-82-2000 | Fax.+81-550-82-2379 | |