1,3-イソベンゾフランジオン，テトラヒドロメチルの
チャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験

In Vitro Chromosomal Aberration Test of
Tetrahydromethyl-1,3-isobenzofuranedione on Cultured Chinese Hamster Cells

要約

1,3-イソベンゾフランジオン，テトラヒドロメチルの培養細胞に及ぼす細胞遺伝学的影響について，チャイニーズ・ハムスター培養細胞(CHL/IU)を用いて染色体異常試験を実施した．

連続処理(24時間)および短時間処理(6時間)における 50% 細胞増殖抑制濃度は，連続処理(24時間)では 0.30 mg/ml，短時間処理(6時間)の S9 mix 非存在下および S9 mix 存在下ではそれぞれ 0.40 mg/ml および 1.0 mg/ml であった．各系列での処理濃度は，連続処理および短時間処理の S9 mix 非存在下では，50% 細胞増殖抑制濃度の2倍濃度を最高処理濃度とし，公比2で5濃度設定した．なお，48時間連続処理の濃度は，24時間連続処理と同じ濃度に設定した．短時間処理の S9 mix 存在下では，1.7 mg/ml(10 mM)を最高処理濃度とし，公比2で5濃度設定した．連続処理では，S9 mix 非存在下で24時間および48時間連続処理後，短時間処理では S9 mix 存在下および非存在下で6時間処理(18時間の回復時間)後，標本を作製し，検鏡することにより染色体異常誘発性を検討した．染色体分析が可能な最高濃度は，24時間および48時間連続処理では 0.30 mg/ml，短時間処理の S9 mix 非存在下および S9 mix 存在下では，それぞれ 0.20 mg/ml および 0.43 mg/ml の濃度であったことから，これらの濃度を高濃度群として3濃度群を観察対象とした．

CHL/IU 細胞を24時間連続処理した高濃度群(0.30 mg/ml)においては，観察した細胞の 4.0% に染色体の構造異常(gap を含む)が誘発された．しかしながら，発生頻度が低いことから，生物学的には陰性であると判定した．また，いずれの処理群においても，倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．48時間連続処理したいずれの処理群においても，染色体の構造異常の誘発作用は認められなかった．高濃度群で観察した細胞の 1.13% に倍数性細胞の誘発が認められた．短時間処理では，S9 mix 非存在下において，いずれの処理群でも染色体の構造異常や倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．S9 mix 存在下では，いずれの処理群でも染色体の構造異常の誘発作用は認められなかった．しかしながら，すべての処理群において倍数性細胞が誘発され，その頻度は 1.25〜1.88% であった．

以上の結果より，本試験条件下で 1,3-イソベンゾフランジオン，テトラヒドロメチルは，染色体の数的異常に関して疑陽性と結論した．

方法

1．使用した細胞

リサーチ・リソースバンク(JCRB)から入手(1988年2月，入手時:継代4代，現在12代)したチャイニーズ・ハムスター由来の CHL/IU 細胞を，解凍後継代10代以内で試験に用いた．

2．培養液の調製

培養には，牛胎児血清(FCS:Cansera International)を 10% 添加したイーグル MEM(日水製薬 (株))培養液を用いた．

3．培養条件

2 × 10^4 個の CHL/IU 細胞を，培養液 5 ml を入れたディッシュ(径 6 cm，Corning)に播き，37℃の CO2 インキュベーター(5% CO2)内で培養した．連続処理では，細胞播種3日目に被験物質を加え，24時間および48時間処理した．また，短時間処理では，細胞播種3日目に S9 mix 存在下および非存在下で6時間処理し，処理終了後新鮮な培養液でさらに18時間培養した．

4．被験物質

1,3-イソベンゾフランジオン，テトラヒドロメチル(略号:THMBF，CAS No.:11070-44-3，ロット番号:2522，(日立化成工業 (株))は，淡黄色透明液体で，100 gの水に対しては0.1 g未満，DMSOでは2M，アセトンでは50 mg/mlで溶解し，融点-15℃，沸点290℃，蒸気圧0.0033 mmHg(25℃)で，分子式C9H10O3，分子量166.18，純度99.97 wt%以上(不純物としてメチルテトラヒドロフタル酸0.01%，水マレイン酸0.02% 含む)の3種の異性体混合物である．

被験物質原体は，水，アルコール類等活性水素を持つ溶媒中で反応し，空気中の水分と反応し，開環する．

5．被験物質の調製

被験物質の調製は，使用のつど行った．溶媒は DMSO(和光純薬工業 (株))を用いた．原体を溶媒に溶解して原液を調製し，ついで原液を溶媒で順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を作製した．被験物質調製液は，すべての試験において培養液の 0.5%(v/v)になるように加えた．なお濃度の記載について，純度換算は行わなかった．

6．細胞増殖抑制試験による処理濃度の決定

染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため，被験物質の細胞増殖に及ぼす影響を調べた．被験物質の CHL/IU 細胞に対する増殖抑制作用は，単層培養細胞密度計(MonocellaterTM，オリンパス光学工業 (株))を用いて各群の増殖度を計測し，被験物質処理群の溶媒対照群に対する細胞増殖の比をもって指標とした．

その結果，連続処理における 50% の増殖抑制濃度は，0.30 mg/ml，短時間処理の S9 mix 非存在下および S9 mix 存在下では，それぞれ 0.40 mg/ml および 1.0 mg/mlであった(Fig．1)．

7．実験群の設定

細胞増殖抑制試験の結果より，染色体異常試験において，連続処理および短時間処理の S9 mix 非存在下では 50% 増殖抑制濃度の2倍濃度を最高処理濃度とし，公比2で5濃度を設定した(連続処理:0.038，0.075，0.15，0.30，0.60 mg/ml，短時間処理の S9 mix 非存在下:0.050，0.10，0.20，0.40，0.80 mg/ml)．短時間処理の S9 mix 存在下では，1.7 mg/ml(10 mM)を最高処理濃度とし，公比2で5濃度設定した(0.11，0.21，0.43，0.85，1.7 mg/ml)．なお，連続処理の48時間処理群の濃度は，24時間処理群と同じ濃度に設定した．陽性対照物質として用いたマイトマイシンC(MC，協和醗酵工業 (株))およびシクロホスファミド(CPA，Sigma Chemical Co.)は，注射用水((株) 大塚製薬工場)に溶解して調製した．それぞれ染色体異常を誘発することが知られている濃度を適用した．

染色体異常試験においては1濃度あたり4枚ディッシュを用い，そのうちの2枚は染色体標本を作製し，別の2枚については単層培養細胞密度計により細胞増殖率を測定した．

8．染色体標本作製法

培養終了の2時間前に，コルセミドを最終濃度が約 0.1μg/ml になるように培養液に加えた．染色体標本の作製は常法に従って行った．スライド標本は各ディッシュにつき6枚作製した．作製した標本を 3% ギムザ溶液で染色した．

9．染色体分析

細胞増殖率測定の結果と分裂指数により，20% 以上の相対増殖率で，かつ2ディッシュともに 0.5% 以上の分裂指数を示した最も高い濃度を観察対象の最高濃度群とし，観察対象の3濃度群を決定した．その結果(Table 1，2)，連続処理では 0.30 mg/ml，短時間処理の S9 mix 非存在下および存在下においては，それぞれ 0.20 mg/ml および 0.43 mg/ml が，染色体分析の可能な最高濃度であったことから，これらの濃度を含む3濃度群を観察対象とした．

作製したスライド標本のうち，1つのディッシュから得られた異なるスライドを，4名の観察者がそれぞれ処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した．染色体の分析は，日本環境変異原学会，哺乳動物試験(MMS)研究会1)による分類法に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型のギャップ，切断，交換などの構造異常の有無と倍数性細胞(polyploid)の有無について観察した．また構造異常については1群200個，倍数性細胞については1群800個の分裂中期細胞を分析した．

10．記録と判定

無処理対照，溶媒および陽性対照群と被験物質処理群についての分析結果は，観察した細胞数，構造異常の種類と数，倍数性細胞の数について集計し，各群の値を記録用紙に記入した．

染色体異常を有する細胞の出現頻度について，溶媒の背景データと被験物質処理群間でフィッシャーの直接確率法2)(多重性を考慮して familywise の有意水準を 5% とした)により，有意差検定を実施した．また，フィッシャーの直接確率法で有意差が認められた場合には，用量依存性に関してコクラン・アーミテッジの傾向性検定3) (p<0.05)を行った．最終的な判定は，統計学的および生物学的な評価に基づいて行った．

結果および考察

連続処理による染色体分析の結果を Table 1 に示した．1,3-イソベンゾフランジオン，テトラヒドロメチルを加えて24時間連続処理した高濃度群(0.30 mg/ml)では，観察した細胞の 4.0% に染色体の構造異常(gap を含む)が誘発された．しかしながら，検体添加時に培地の黄色が認められたこと，異常頻度が低く，48時間処理では構造異常の有意増加が認められないことなど，生物学的な見地から考え，構造異常については陰性であると判定した．また，いずれの処理群においても，倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．48時間連続処理したいずれの処理群においても，染色体の構造異常の誘発作用は認められなかった．高濃度群(0.30 mg/ml)で観察した細胞の 1.13% に倍数性細胞の誘発が認められた．

短時間処理による染色体分析の結果を Table 2 に示した．1,3-イソベンゾフランジオン，テトラヒドロメチルを加えて S9 mix 非存在下で短時間処理したいずれの濃度群においても染色体の構造異常および倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．一方，S9 mix 存在下では，いずれの処理群でも染色体の構造異常の誘発作用は認められなかった．しかしながら，すべての処理群において倍数性細胞が誘発され，その頻度は 1.25〜1.88% であった．倍数性細胞の発生頻度は低いながら，2系列で有意に誘発が確認されたため，疑陽性と判定した．

従って，1,3-イソベンゾフランジオン，テトラヒドロメチルは，上記の試験条件下での染色体の数的異常誘発に関して疑陽性と結論した．

文献

1)日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編，"化学物質による染色体異常アトラス," 朝倉書店，東京，1988．
2)吉村　功編，"毒性・薬効データの統計解析，事例研究によるアプローチ," サイエンティスト社，東京，1987．
3)吉村　功，大橋靖夫編，"毒性試験講座14，毒性試験データの統計解析," 地人書館，東京，1992，pp.218-223．

連絡先
試験責任者：田中憲穂
試験担当者：山影康次，日下部博一，中川ゆづき，水谷正寛，
橋本恵子，出石由紀
(財)食品薬品安全センター秦野研究所
〒257　神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Noriho Tanaka(Study director)
Kohji Yamakage，Hirokazu Kusakabe，Yuzuki Nakagawa，Masahiro Mizutani，Keiko Hashimoto，Yuki Izushi
Hatano Research Institute，Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai，Hadano，Kanagawa，257，Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627