1,3-イソベンゾフランジオン，テトラヒドロメチルの細菌を用いる
復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of Tetrahydromethy-1,3-isobenzofuranedione on Bacteria

要約

1,3-イソベンゾフランジオン，テトラヒドロメチルについて，細菌を用いる復帰突然変異試験を実施した．

検定菌として，Salmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA1537 1)および Escherichia coli WP2 uvrA 2,3)の5菌株を用い，S9 mix 無添加および添加試験のいずれも，用量設定試験で抗菌性が認められたことから，本試験は S9 mix 無添加試験では 62.5〜2000μg/プレートの範囲(WP2 uvrA は 156〜5000μg/プレート)，S9 mix 添加試験では 313〜5000μg/プレートで実施した．

その結果，2回の本試験とも，用いた5種類の検定菌のいずれの用量においても，溶媒対照値の2倍以上となる復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．

以上の結果から，1,3-イソベンゾフランジオン，テトラヒドロメチルは，用いた試験系において変異原性を有しない(陰性)と判定された．

方法

〔検定菌〕

Salmonella typhimurium TA100
Salmonella typhimurium TA1535
Escherichia coli WP2 uvrA
Salmonella typhimurium TA98
Salmonella typhimurium TA1537

S. typhimurium の4菌株は1975年10月31日にアメリカ合衆国，カリフォルニア大学のB.N. Ames 博士から分与を受けた．

E. coli WP2 uvrA 株は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた．

検定菌は-80℃以下で凍結保存したものを用い，各菌株の特性確認は，凍結保存菌の調製時に，アミノ酸要求性，UV感受性，および膜変異(rfa)とアンピシリン耐性因子 pKM101(プラスミド)の有無について調べ，特性が維持されていることを確認した．試験に際して，ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し，37℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした．

〔被験物質〕

1,3-イソベンゾフランジオン，テトラヒドロメチル(CAS No. 11070-44-3)は，分子量166.18 の淡黄色透明液体(受領時:無色透明液体)である．用いた被験物質は，日立化成工業(株)製造，ロット番号 2522，純度 99.97 wt%(異性体の混合物として，不純物:0.01％ メチルテトラヒドロフタル酸，0.02％ 無水マレイン酸)であり，日立化成工業(株)から供与された．被験物質は，使用時まで密封，遮光して冷蔵した．なお，試験終了後に日立化成工業(株)において，被験物質の化学分析を行った結果，純度は 99.13 wt% であった．

1,3-イソベンゾフランジオン，テトラヒドロメチルは，ジメチルスルホキシド(DMSO，ロット番号:ESK4546，和光純薬工業(株))に溶解して最高濃度の調製液を調製した後，同溶媒で公比約3ないし2で希釈し，速やかに試験に用いた．

〔陽性対照物質〕

用いた陽性対照物質およびその溶媒は以下のとおりである．
AF2:2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(上野製薬(株))
SA:アジ化ナトリウム(和光純薬工業(株))
9AA:9-アミノアクリジン(Sigma Chem. Co.)
2AA:2-アミノアントラセン(和光純薬工業(株))
AF2 および 2AA は DMSO に溶解したものを-20℃で凍結保存し，用時解凍した．9AAは DMSO に，SA は純水に溶解し，速やかに試験に用いた．

〔培地および S9 mix の組成〕

1)　トップアガー(TA菌株用)

下記の水溶液(A)および(B)を容量比 10:1 の割合で混合した．
(A)バクトアガー(Difco)0.6％
塩化ナトリウム0.5％
(B)*L-ヒスチジン0.5mM
D-ビオチン0.5mM
*:WP2 uvrA 用には，0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた．

2)　合成培地

培地は，極東製薬工業(株)製の最少寒天培地を用いた．なお，培地1 l あたりの組成は下記のとおりである．
硫酸マグネシウム・7水和物0.2 g
クエン酸・1水和物2 g
リン酸水素二カリウム10 g
リン酸一アンモニウム1.92 g
水酸化ナトリウム0.66 g
グルコース20 g
バクトアガー(Difco)15 g
径 90 mm のシャーレ1枚あたり 30 ml を流して固めてある．

3)　S9 mix

1 ml中下記の成分を含む
S9**0.1 ml
塩化マグネシウム8μmol
塩化カリウム33μmol
グルコース-6-リン酸5μmol
NADH4μmol
NADPH4μmol
ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)100μmol
**:7週齢の Sprague-Dawley 系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および 5, 6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製したS9を用いた．

〔試験方法〕

プレインキュベーション法 4)により，S9 mix 無添加試験および S9 mix 添加試験を行った．

小試験管中に，被験物質調製液 0.1 ml，リン酸緩衝液 0.5 ml(S9 mix 添加試験においては S9 mix 0.5 ml)，検定菌液 0.1 ml を混合し，37℃で20分間往復振とう培養したのち，トップアガー2 mlを加えて混和し，合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりに使用溶媒，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量は各Table 中に示した．溶媒および陽性対照群は，同時に実施した他の試験と共通とした．培養は37℃で48時間行い，生じた変異コロニー数を算定した．抗菌性の有無については，肉眼的あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌膜の状態から判断した．用いた平板は用量設定試験においては，溶媒および陽性対照群では3枚ずつ，各用量については1枚ずつとした．また，本試験においては，両対照群および各用量につき，3枚ずつを用い，それぞれその平均値と標準偏差を求めた．用量設定試験は1回，本試験は2回実施し，結果の再現性の確認を行った．

〔判定基準〕

用いた5種の検定菌のうち，1種以上の検定菌の S9 mix 無添加あるいは S9 mix 添加条件において，被験物質を含有する平板上における変異コロニー数の平均値が，溶媒対照のそれに比べて2倍以上に増加し，かつ，その増加に再現性あるいは用量依存性が認められた場合に，当該被験物質は本試験系において変異原性を有する(陽性)と判定することとした．ただし，2回の本試験の一方でのみ変異コロニー数の平均値が溶媒対照値の2倍以上となる用量が認められた場合において，その溶媒対照値が10以下であり，変異コロニー数の増加に用量依存性が認められない場合は陰性とすることとした．

結果および考察

〔用量設定試験〕

1,3-イソベンゾフランジオン，テトラヒドロメチルについて 50〜5000μg/プレートの範囲で公比を約3として，試験を実施した．その結果，S9 mix 無添加試験では 1500μg/プレート以上(WP2 uvrA は 5000μg/プレート)で，S9 mix 添加試験では TA100 および TA1537 において 5000μg/プレートで抗菌性が認められた．

したがって，本試験における最高用量は，S9 mix 無添加試験では 2000μg/プレート(WP2 uvrA は 5000μg/プレート)，S9 mix 添加試験では 5000μg/プレートとした．

〔本試験〕

S9 mix 無添加試験および添加試験でともに，上記の最高用量に基づいて公比2で5〜7用量を設定して2回の本試験を実施した(Table 1，2)．その結果，いずれの検定菌においても，溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加は認められなかった．以上の結果に基づき，1,3-イソベンゾフランジオン，テトラヒドロメチルは，用いた試験系において変異原性を有しない(陰性)と判定した．

文献

1)D.M. Maron, B.N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983).
2)S. Venitt, C. Crofton-Sleigh, "Evaluation of Short-Term Tests for Carcinogens," eds. by F.J. de Serres, J. Ashby, Elsevier/North-Holland, New York, 1981, pp. 351-360.
3)M.H.L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures," eds. by B.J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp.161-187.
4)T. Matsushima, T. Sugimura, M. Nagao, T. Yahagi, A. Shirai, M. Sawamura, "Short-Term Test Systems for Detecting Carcinogens," eds. by K.H. Norpoth, R.C. Garner, Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 1980, pp. 273-285.

連絡先
試験責任者：澁谷　徹
試験担当者：原　　巧，坂本京子，川上久美子
(財)食品薬品安全センター　秦野研究所
〒257 秦野市落合 729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Tohru Shibuya(Study Director)
Takumi Hara, Kyoko Sakamoto,Kumiko Kawakami,
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa 257 Japan
Tel +81-463-82-4751FAX +81-463-82-9627