1,3-イソベンゾフランジオン，テトラヒドロメチルのラットを用いる
単回経口投与毒性試験
Single Dose Oral Toxicity Test of Tetrahydromethyl-1,3-isobenzofuranedione in Rats
要約
1,3-イソベンゾフランジオン，テトラヒドロメチルは，主に電子部品などの絶縁体の材料となるエポキシ樹脂の硬化剤として使用されている化学物質である．
今回，OECD既存化学物質安全性点検に係る毒性調査の一環として，1,3-イソベンゾフランジオン，テトラヒドロメチルの0(対照)，500，1000および2000 mg/kgを1群雌雄各5匹のCrj:CD(SD系)ラットに単回経口投与する毒性試験を実施し，以下の結果を得た．
死亡はいずれの群にも認められなかった．一般状態の観察では，投与当日(1日目)に活動性の低下，緩徐呼吸および腹臥姿勢が2000 mg/kg群の雌雄に観察されたが，これらの症状は投与翌日(2日目)あるいは3日目までに回復した．
体重では，投与翌日に減少あるいは増加抑制が2000 mg/kg群の雌雄に認められたが，4日目から対照群とほぼ同様な体重増加が認められた．
剖検では，前胃の肥厚が1000 mg/kg群以上の雌雄にみられ，2000 mg/kg群の雌では前胃と肝臓との癒着もみられた．前胃の病理組織学的検査では，肥厚部位に扁平上皮の過形成および粘膜下の肉芽腫性炎症が認められたほか，前胃と肝臓との癒着部位では異物肉芽腫が観察された．
1,3-イソベンゾフランジオン，テトラヒドロメチルのLD50値は，雌雄とも2000 mg/kgを上回るものと推定された．
方法
1．被験物質および投与液の調製
1,3-イソベンゾフランジオン，テトラヒドロメチル(純度99.97%，Lot No. 2522)は，水に難溶(0.1 g/H2O 100 g以下)でアセトンおよびジメチルスルホキシドには易溶の淡黄色透明の液体である．入手後の被験物質は，室温，遮光下で保管し，投与終了後に供給源にて分析を行い，試験期間中安定であったことを確認した．媒体にはコーンオイル(ナカライテスク(株)，Lot No. V5P5523)を使用し，これに被験物質を5，10および20 w/v%濃度になるように溶解して投与液を調製した．調製は投与の2日前に行い，調製した投与液は冷蔵，遮光下に保管した．なお，調製した各投与液の濃度を測定し，設定値の±5%以内にあることを確認した．また，調製前に，本調製法による0.1，10および20 w/v%溶液が冷蔵，遮光下で調製後8日間，さらに室温で6時間安定であることを確認した．
2．使用動物および飼育条件
5週齢のSprague-Dawley系ラット(Crj:CD，日本チャールス・リバー(株))を雌雄各26匹購入し，7日間の検疫馴化を行ったのち，雌雄各20匹を選んで6週齢で試験に使用した．投与日の体重は，雄が172.1〜193.1 g，雌が125.4〜139.9 gであった．動物は，温度24±2℃，湿度55±10%，照明7時〜19時および換気回数13回/時に設定したバリアーシステム飼育室で床敷(ホワイトフレーク，日本チャールス・リバー(株))を入れたポリカーボネイト製ケージに，1ケージ当たり2〜3匹ずつ収容して，高圧蒸気滅菌処理した固型飼料(MF，オリエンタル酵母工業(株))および次亜塩素酸ナトリウムを添加(約2 ppm)した水を自由に摂取させた．ただし，投与前日の17時から投与後約3時間まで絶食し，水のみを与えた．
3．投与量，投与方法，試験群構成および群分け
投与量は，単回投与毒性予備試験(投与量:500，1000および2000 mg/kg)の結果から設定した．すなわち，当該試験において，いずれの用量でも死亡は認められなかった．また，一般状態では1000 mg/kg以上の用量で活動性の低下，緩徐呼吸などが投与日に認められ，体重では2000 mg/kgの用量で投与翌日に減少または増加抑制がみられた．以上より，本試験での投与量は，高用量をOECD毒性試験ガイドラインに従い2000 mg/kgとし，以下公比2で除した1000および500 mg/kgの計3用量を設定した．
投与経路は経口とし，約16時間絶食させた動物に胃管を用いて，投与液を1回強制投与した．投与容量は10 ml/kgとし，個別ごとに測定した体重に基づいて算出した．給餌は投与後約3時間に行った．
試験群は，上記3用量に，コーンオイルを投与する対照を加え計4群とした．1群当たりの動物数は，各群とも雌雄各5匹を設けた．
群分けは，投与前日の体重を基に層別連続無作為化法で行った．
4．観察項目
1) 一般状態の観察および体重の測定
観察期間は投与後14日間とし，この間に一般状態の観察および死亡の有無を投与日(1日目)は投与後6時間まで経時的に，その後は少なくとも1日1回行った．体重は投与直前，ならびに2，4，6，8，11および15日目に測定した．
2) 病理学的検査
観察期間終了後，エーテル麻酔下に放血致死させたのち剖検した．その結果，1000および2000 mg/kg群で胃(前胃)に肉眼的な変化がみられたことから，摘出して10%中性緩衝ホルマリン溶液に固定した．また，変化のみられた代表例について，胃を常法に従ってパラフィン切片とし，ヘマトキシリン・エオジン染色を施して光学顕微鏡下で観察した．
結果
1．死亡率，LD50値
死亡はいずれの群にも認められず，LD50値は雌雄とも2000 mg/kgを上回るものと推定された．
2．一般状態
2000 mg/kg群では，投与後15ないし30分から活動性の低下，緩徐呼吸および腹臥姿勢が雌雄にみられ始め，投与後45分までに緩徐呼吸が雌雄全例，活動性の低下が雄1例および雌3例ならびに腹臥姿勢を示すものが雄4例および雌2例に観察された．これらの症状は，経過とともに徐々に回復し，腹臥姿勢は投与後3時間までにすべての動物で回復した．活動性の低下および緩徐呼吸については，投与の翌日(2日目)ないし3日目に回復し，以後の観察期間においても変化はみられなかった．
3．体重
2000 mg/kg群では，2日目に雄で体重減少，雌で体重増加抑制が認められたが，4日目から雌雄とも対照群とほぼ同様な体重増加が認められた．
4．病理学的検査
1000 mg/kg群では，前胃粘膜の肥厚が雄2例および雌1例に認められた．2000 mg/kg群では，前胃粘膜の肥厚が雌雄全例にみられ，さらに雌1例では前胃と肝臓との癒着も認められた．前胃で肥厚がみられた1000および2000 mg/kg群の代表例(各群とも雌雄各1例)で実施した病理組織学的検査では，肥厚部位に扁平上皮の過形成および粘膜下の肉芽腫性炎症が認められた．さらに，前胃と肝臓との癒着部位では異物肉芽腫が認められた．
考察
1,3-イソベンゾフランジオン，テトラヒドロメチルについて，ラットを用いる単回経口投与毒性試験を実施した．
いずれの群の雌雄にも観察期間を通じて死亡例は認められず，LD50値は雌雄とも2000 mg/kgを上回るものと推定された．一般状態では，2000 mg/kg群の雌雄に活動性の低下，緩徐呼吸および腹臥姿勢が投与当日に観察されたが，3日目までに回復した．体重では2000 mg/kg群の雌雄で投与翌日に減少あるいは増加抑制が認められたが，4日目には回復した．剖検では，1000 mg/kg群以上の雌雄に前胃粘膜の肥厚がみられ，病理組織学的には扁平上皮の過形成および粘膜下の肉芽腫性炎症が認められた．さらに，前胃と肝臓との癒着がみられる例もあった．これらの変化は，前胃粘膜の傷害に対する上皮の反応性の増殖像および粘膜下組織の修復像と考えられ，投与後の初期に受けた被験物質の直接刺激に起因したものと考えられた．
| 連絡先 |
| 試験責任者： | 古川浩美 |
| 試験担当者： | 一村憲児，村田英治，斉藤琢也，和田 肇，幸 邦憲，
一鬼 勉，鍬先恵美子 |
| (株)パナファーム・ラボラトリーズ 安全性研究所 |
| 〒869-04 熊本県宇土市栗崎町1285 |
| Tel 0964-23-5111 | Fax 0964-23-2282 | |
| Correspondence |
| Authors: | Hiromi Furukawa(Study director)
Kenji Ichimura，Eiji Murata，Takuya Saitoh，
Hajime Wada，Kuninori Yuki，
Tsutomu Ichiki, Emiko Kuwasaki |
| Safety Assessment Laboratory, Panapharm Laboratories Co., Ltd. |
| 1285 Kurisaki-machi, Uto-shi, Kumamoto, 869-04, Japan |
| Tel +81-964-23-5111 | Fax +81-964-23-2282 | |