シクロヘキセンの細菌を用いる復帰変異試験

Reverse Mutation Test of Cyclohexene in Bacteria

要約

シクロヘキセンについて，細菌を用いる復帰変異試験を実施した．

供試菌株として，ネズミチフス菌Salmonella typhimurium TA100，TA98，TA1535及びTA1537並びにEscherichia coli WP2 uvrAの5菌株を用いた．

濃度設定試験及び本試験の結果，菌株及び代謝活性化の有無にかかわらず，いずれの濃度においても沈殿/結晶の析出は認められなかった．また，E. coli WP2 uvrAの非代謝活性化においては試験菌株に対する生育阻害は認められなかったが，S. typhimurium TA100，TA98，TA1535及びTA1537においては代謝活性化の有無にかかわらず625 μg/plate以上，E. coli WP2 uvrAの代謝活性化においては1250 μg/plate以上の被験物質処理群において試験菌株に対する生育阻害が認められた．濃度設定試験及び本試験のいずれの濃度においても，菌株及び代謝活性化の有無にかかわらず，溶媒対照と比較して2倍以上の復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．

以上の結果より，本試験条件下においてシクロヘキセンは細菌に対して復帰突然変異誘発性を示さない(陰性)と判定した．

方法

1.　試験菌株

試験菌株としてヒスチジン要求性のS. typhimurium(TA100，TA98，TA1535，TA1537)並びにトリプトファン要求性のE. coli WP2 uvrAの5種類を選択した．

これらの菌株はいずれも1997年10月9日に国立医薬品食品衛生研究所・変異遺伝部から入手した．試験菌株は-80 ℃超低温フリーザで保存したものを用いた．各菌株は，アミノ酸要求性，紫外線(UV)感受性，膜変異(rfa)及びアンピシリン耐性因子pKM101(プラスミド)の有無について調べ，特性が維持されていることを確認した．

試験に際して，解凍した菌液をニュートリエントブロスNo. 2(OXOID Ltd.)を入れた培養用三角フラスコに一定量を接種し，37 ℃で約8時間振盪培養したものを検定菌液とした．分光光度計を用いて660 nmの吸光度を測定し，試験菌液の増殖を確認した．

2.　培地の調製

1)　最少グルコース寒天平板培地(プレート)

最少グルコース寒天平板培地はオリエンタル酵母工業(株)から購入し，試験に用いた．本プレート組成は，Vogel-Bonnerの最少培地Eを含む水溶液(最終濃度:0.02 %硫酸マグネシウム7水塩，0.2 %クエン酸1水塩，1 %リン酸二カリウム無水塩，0.192 %リン酸一アンモニウム，0.06 %水酸化ナトリウム)に2 %グルコース(和光純薬工業(株))及び1.5 %の寒天(OXOID Ltd.)を加え，径90 mmの滅菌シャーレ当たり30 mLを分注して固めたものである．

2)　アミノ酸添加軟寒天培地(トップアガー)

0.6 w/v%寒天粉末(Difco Laboratories)及び0.6 w/v%塩化ナトリウムの組成の軟寒天を調製し，これに，S. typhimurium用には0.5 mM D-ビオチン及び0.5 mM L-ヒスチジン水溶液，E. coli用には0.5 mM L-トリプトファン水溶液を1/10容加え，トップアガーとした．

3.　S9 mix

フェノバルビタール及び5,6-ベンゾフラボンを7週齢投与したSprague-Dawley系雄ラットに腹腔内投与した肝臓から調製されたS9並びに補酵素をオリエンタル酵母工業(株)から購入し，S9 mixを調製した．

4.　被験物質

シクロヘキセン(ロット番号:HE-00-02-09，旭化成工業(株)，岡山)は純度98.63 wt%(不純物:ベンゼン0.799 %，シクロヘキサン0.526 %，水分0.003 %，酸化防止剤として2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol 0.01 %を含む)，融点103.7 ℃，沸点83.3 ℃，蒸気圧9.93 kPa(25 ℃)，比重 0.811(20 ℃)の刺激臭を有する無色の液体で，密封容器で冷暗所に保存した．

5.　被験液の調製

溶媒は，ジメチルスルホキシド(DMSO:試薬特級，和光純薬(株))では被験物質が分離し不適当であったため，エタノール(試薬特級，ナカライテスク)を用いた．被験物質を溶媒で希釈して原液(50.0 mg/mL)を調製し，次いで順次溶媒で希釈して各濃度の被験液を調製した．

6.　試験用量の設定

濃度設定試験は、最高用量を5000 μg/plateとしてエタノールにより公比4で7段階希釈した計8濃度を実施した．培養終了後の観察において，E. coli WP2 uvrA株の非代謝活性化群を除く全ての菌株の1250 μg/plate以上の被験物質処理群において，菌株に対する生育阻害が観察された．一方，菌株及び代謝活性化の有無にかかわらず被験物質を処理した全ての寒天培地シャーレにおいて，結晶/沈殿の析出は認められなかった．

濃度設定試験の結果，試験菌株に対する生育阻害が認められたため，本試験では，各菌株の生育阻害の認められた用量，すなわち，S. typhimurium TA100，TA98，TA1535，TA1537の代謝活性化群及び非代謝活性化群，E. coli WP2 uvrAの代謝活性化群においては，1250 μg/plate，E. coli WP2 uvrAの非代謝活性化群においては5000 μg/plateを最高用量として以下公比2で6段階希釈した計7濃度の用量を設定した．

7.　陽性対照物質

陽性対照物質として下記に示した5種類の物質を使用した．
2-(2-furyl)-3-(5-nitro-2-furyl)acrylamide(AF-2，和光純薬工業(株))
Sodium azide(SAZ，和光純薬工業(株))
2-methoxy-6-chloro-9-[3-(2-chloroethyl)-amino
propylamino] acridine・2HCl		(ICR-191，Polysciences, Inc.)
2-aminoanthracene(2AA，ナカライテスク)
Benzo[a]pyrene(B[a]P，ナカライテスク)

AF-2，ICR-191，2AA及びB[a]PはDMSOを用いて溶解し，SAZは，注射用水(日局，(株)大塚製薬工場)で溶解し，それぞれ目的濃度に調製した．

8.　試験方法

Amesらの原法の改良法1,2)であるプレインキュベーション法に準じて，非代謝活性化群及び代謝活性化群それぞれについて試験を実施した．試験管に，使用溶媒，被験液あるいは陽性対照物質溶液を100 μL，次いで非代謝活性化群の場合，0.1 Mナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)を500 μL，代謝活性化群の場合，S9 mixを500 μL添加した．さらに，試験菌液100 mLを加え，37 ℃で20分間振盪培養(プレインキュベーション)した．培養終了後，あらかじめ45 ℃に保温したトップアガーを2 mL添加し，混合液をプレート上に重層した．37 ℃で48時間培養した後，沈殿/結晶の析出の有無及び被験物質の試験菌株の生育阻害を実体顕微鏡を用いて観察した．次いで，復帰突然変異により生じたコロニーを計数した．計数に際しては自動コロニーカウンター(バイオマルチスキャナーBMS-400，東洋測器(株))を用いた．各濃度につき3枚のプレートを使用した．

9.　結果判定

復帰変異コロニー数が溶媒対照のほぼ2倍以上に増加し，かつ，再現性あるいは被験物質の用量に依存性が認められた場合に，陽性と判定した．なお，判定に際しては統計学的処理は行わなかった．

結果及び考察

濃度設定試験の結果をTable 1に，本試験の結果をTable 2に示した．

濃度設定試験及び本試験の結果，菌株及び代謝活性化の有無にかかわらず，いずれの濃度においても沈殿/結晶の析出は認められなかった．E. coli WP2 uvrAの非代謝活性化においては試験菌株に対する生育阻害は認められなかったが，S. typhimurium TA100，TA98，TA1535及びTA1537においては代謝活性化の有無にかかわらず625 μg/plate以上，E. coli WP2 uvrAの代謝活性化においては1250 μg/plate以上の被験物質処理群において試験菌株に対する生育阻害が認められた．また，菌株及び代謝活性化の有無にかかわらず，溶媒対照と比較して2倍以上の復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．一方，陽性対照群では各菌株の溶媒対照群に比較して2倍以上の復帰変異コロニーを誘発した．

以上の結果より，本試験条件下においてシクロヘキセンは細菌に対して復帰突然変異誘発性を示さない(陰性)と判定した．

文献

1)D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983).
2)T. Matsushima, T. Sugimura, M. Nagao, T. Yahagi, A. Shirai, M. Sawamura, "Short-Term Test Systems for Detecting Carcinogens," eds. By K. H. Norpoth, R. C. Garner, Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 1980, pp.273-285.

連絡先
試験責任者：尾崎正康*
試験担当者：伊藤加奈，高橋直紀，三浦康義，古田鮎美
(株)ボゾリサーチセンター
〒412-0039　静岡県御殿場市かまど1284
Tel 0550-82-9922 Fax 0550-82-9922
*退職のため，三浦康義，望月 肇が報告書を作成した．

Correspondence
Authors:Masayasu Ozaki(Study Director)
Kana Ito, Naoki Takahashi, Yasuyoshi Miura, Ayumi Furuta
Bozo Research Center Inc.
1284 Kamado, Gotemba-shi, Shizuoka, 412-0039, Japan
Tel +81-550-82-9922Fax +81-550-82-9922