チオフェンの細菌を用いる復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of Thiophene on Bacteria

要約

OECD既存化学物質安全性調査事業の一環として，チオフェンについて，細菌を用いる復帰突然変異試験をプレート法により実施し，陰性の結果を得た．

検定菌として， Salmonella typhimurium TA100, TA1535, TA98, TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAの5菌株を用い，S9 mix無添加および添加の条件でプレート法により，用量設定試験を50～5000 μg/プレートの用量で行ったところ，S9 mix無添加試験，添加試験のいずれもWP2 uvrA 以外の検定菌において，高用量群で抗菌性が認められた．したがって，本試験では S9 mix無添加試験および添加試験のいずれもTA1537では78.1 ～2500 μg/プレート，WP2 uvrAでは313～5000 μg/プレート，その他は156～5000 μg/プレートの範囲で用量を設定して試験を実施した．

その結果， S9 mix無添加試験および添加試験のいずれも 2500 ～5000 μg/プレートの用量で抗菌性が認められた．復帰変異コロニー数は，2回の本試験とも，用いた検定菌について，いずれの用量においても増加は認められなかったことから，チオフェンは用いた試験系において変異原性を有しない(陰性)と判定された．

方法

〔検定菌〕

Salmonella typhimurium TA100

Salmonella typhimurium TA1535

Escherichia coli WP2 uvrA

Salmonella typhimurium TA98

Salmonella typhimurium TA1537

S. typhimuriumの4菌株1)は1975年10月31日にアメリカ合衆国，カリフォルニア大学のB.N. Ames博士から分与を受けた．

E. coli WP2 uvrA 株2)は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた．

検定菌は－ 80℃以下で凍結保存したものを用い，ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し，37℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした．

〔被験物質〕

チオフェン (CAS No. 110-02-1)は，分子量 84.14の無色透明の液体である．試験には，東京化成工業(株)製，〔ロット番号：FGB01，純度98％(不純物：不明)〕のものを購入し，使用時まで冷蔵保管した．

チオフェンは，ジメチルスルホキシド (DMSO)に溶解性がよいことから，DMSOに50 mg/mlまたは25 mg/mlの割合で溶解した後，同溶媒で公比約3ないし2で希釈し，速やかに試験に用いた．

試験の開始に先立って，チオフェンの DMSO 溶液中での安定性試験および含量測定試験を実施した．安定性試験においては，低濃度(0.781 mg/ml)溶液は本試験Ⅱで調製したものについて，また高濃度(168 mg/ml)溶液は染色体異常試験で調製したものについて，室温遮光条件下で，安定性を調べた．その結果，調製4時間後における各濃度の平均含量は，それぞれ初期値(0時間) の平均値に対して，100および101％であった．また，含量測定試験を行った結果，調製液の濃度は，低濃度は89.7％とやや低い値であったが，高濃度は95.2％であった．

〔陽性対照物質〕

用いた陽性対照物質およびその溶媒は以下のとおりである．

AF2:	2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド	(上野製薬(株))
SA:	アジ化ナトリウム	(和光純薬工業(株))
9AA:	9-アミノアクリジン	(Sigma Chem. Co.)
2AA:	2-アミノアントラセン	(和光純薬工業(株))

AF2, 2AA は DMSO(和光純薬工業(株))に溶解したものを－20℃で凍結保存し，用時解凍した．9AAはDMSO に，SAは純水に溶解し，速やかに試験に用いた．

〔培地および S9 mix の組成〕

1)　トップアガー

下記の水溶液 (A)および(B)を容量比10:1の割合で混合した．

(A)	バクトアガー(Difco)	0.6	％
	塩化ナトリウム	0.5	％
(B)*	L-ヒスチジン	0.5	mM
	D-ビオチン	0.5	mM

*:	WP2 uvrA用には，0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた．

2)　合成培地

培地は，日清製粉 (株)製の最少寒天培地を用いた．なお，培地1 lあたりの組成は下記のとおりである．

硫酸マグネシウム・7水和物	0.2 g
クエン酸・1水和物	2 g
リン酸水素二カリウム	10 g
リン酸一アンモニウム	1.92 g
水酸化ナトリウム	0.66 g
グルコース	20g
バクトアガー(Difco)	15g

径 90 mmのシャーレ1枚あたり30 mlを流して固めてある．

3)　S9 mix

1 ml中下記の成分を含む

S9**	0.1　 ml
塩化マグネシウム	8 μmol
塩化カリウム	33 μmol
グルコースー6-リン酸	5 μmol
NADH	4 μmol
NADPH	4 μmol
ナトリウムーリン酸緩衝液(pH 7.4)	100 μmol

**:	7週齢の Sprague-Dawley 系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および5, 6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製したS9を用いた．

〔試験方法〕

プレート法により， S9 mix無添加試験およびS9 mix 添加試験を行った．

小試験管中にトップアガー 2 ml，被験物質調製液0.1 ml，リン酸緩衝液0.5 ml(S9 mix添加試験においては S9 mix 0.5 ml)，検定菌液0.1 mlを混合したのち合成培　　　　　　　地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりにDMSO，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量は各Table中に示した．培養は37℃で48時間行い，生じた変異コロニー数を算定した．抗菌性の有無については，肉眼的あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌膜の状態から判断した．用いた平板は用量設定試験においては，溶媒および陽性対照群では3枚ずつ，各用量については1枚ずつとした．また，本試験においては両対照群および各用量につき，3枚ずつを用い，それぞれの平均値と標準偏差を求めた．用量設定試験は1回，本試験は同一用量について2回実施し，結果の再現性の確認を行った．

〔判定基準〕

用いた 5種の検定菌のうち，1種以上の検定菌のS9 mix無添加あるいはS9 mix添加条件において，被験物質を含有する平板上における変異コロニー数の平均値が，溶媒対照のそれに比べて2倍以上に増加し，かつ，その増加に再現性あるいは用量依存性が認められた場合に，当該被験物質は本試験系において変異原性を有する(陽性)と判定することとした．

結果および考察

〔用量設定試験〕

50～5000 μg/プレートの範囲で公比を約3として，試験を実施したところ，S9 mix 無添加試験，添加試験のいずれも TA1537では1500 μg/プレート以上で，また TA100，TA1535，A98の3菌株では5000 μg/プレートで抗菌性が認められたが，WP2 uvrAのみ最高用量においても抗菌性は認められなかった．

〔本試験〕

結果をそれぞれ Table 1，2に示した．チオフェンの用量を，S9 mix無添加試験，添加試験のいずれもTA1537 では78.1～2500μg/プレート，WP2 uvrAでは313～5000 μg/プレート，その他は156～5000 μg/プレートの範囲で公比を2として設定し試験を実施した．その結果，2回の試験のいずれも，用いた5種類の検定菌のS9 mix無添加試験および添加試験において，溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加は認められなかった．

以上の結果に基づき，チオフェンは，用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した．

文献

1)	D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173 (1983).
2)	M. H. L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures," eds. by B. J . Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp. 161-187.

連絡先

試験責任者: 澁谷　徹

試験担当者：坂本京子，川上久美子，原　　巧，
清水ゆり，堀谷尚古，松木容彦，
中込まどか，中尾美津男，
飯田さやか

(財)食品薬品安全センター　秦野研究所

〒257　秦野市落合 729-5

Tel 0463-82-4751 Fax 0463-82-9627

Correspondence

Authors: Tohru Shibuya(Study Director)
Kyoko Sakamoto, Kumiko Kawakami,
Takumi Hara, Yuri Shimizu,
Naoko Horiya, Yasuhiko Matsuki,
Madoka Nakagomi, Mitsuo Nakao and
Sayaka Iida

Hatano Research Institute, Food and Drug Safety

729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa 257 Japan

Tel +81-463-82-4751 Fax +81-463-82-9627

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	試験担当者：	坂本京子，川上久美子，原　　巧，清水ゆり，堀谷尚古，松木容彦，中込まどか，中尾美津男，飯田さやか
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