1,3-ジブロモプロパンの細菌を用いる復帰変異試験

Reverse Mutation Test of 1,3-Dibromopropane in Bacteria

要約

1,3-ジブロモプロパンについて，細菌を用いる復帰変異試験を実施した．

供試菌株として，ネズミチフス菌Salmonella typhimurium TA100，TA98，TA1535及びTA1537並びにEscherichia coli WP2 uvrAの5菌株を用いた．

濃度設定試験及び本試験の結果，菌株及び代謝活性化の有無にかかわらず，いずれの濃度においても沈殿/結晶の析出は認められなかった．また，全ての試験菌株に対して，代謝活性化の有無にかかわらず，1250 μg/plate以上の被験物質処理群において試験菌株に対する生育阻害が認められた．濃度設定試験及び本試験のいずれにおいても，TA98，TA1537及びWP2 uvrAでは，代謝活性化の有無にかかわらず，また，TA100及びTA1535では非代謝活性化によって溶媒対照と比較し，2倍以上の復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．しかし，TA100の代謝活性化では156 μg/plate以上，TA1535の代謝活性化では19.5 μg/plate以上の処理群において溶媒対照と比較し，2倍以上の復帰変異コロニー数の増加が認められた．

以上の結果から，本試験条件下において1,3-ジブロモプロパンは細菌に対して復帰突然変異誘発性を示す(陽性)と判定した．

材料及び方法

1.　試験菌株

試験菌株としてヒスチジン要求性のS. typhimurium(TA100，TA98，TA1535，TA1537)並びにトリプト ファン要求性のE. coli WP2 uvrAの5種類を選択した．

これらの菌株はいずれも1997年10月9日に国立医薬品食品衛生研究所・変異遺伝部から入手した．試験菌株は-80 ℃超低温フリーザで保存したものを用いた．各菌株は，アミノ酸要求性，紫外線(UV)感受性，膜変異(rfa)及びアンピシリン耐性因子pKM101(プラスミド)の有無について調べ，特性が維持されていることを確認した．

試験に際して，解凍した菌液をニュートリエントブロスNo. 2(UNIPATH LTD.)を入れた培養用三角フラスコに一定量を接種し，37 ℃で約8時間振盪培養したものを検定菌液とした．分光光度計を用いて660 nmの吸光度を測定し，試験菌液の増殖を確認した．

2.　培地の調製

1)　最少グルコース寒天平板培地(プレート)

最少グルコース寒天平板培地はオリエンタル酵母工業(株)から購入した．本プレート組成は，Vogel-Bonnerの最少培地Eを含む水溶液(最終濃度:0.02 %硫酸マグネシウム7水塩，0.2 %クエン酸1水塩，1 %リン酸二カリウム無水塩，0.192 %リン酸一アンモニウム，0.06 %水酸化ナトリウム)に2 %グルコース(和光純薬工業(株))及び1.5 %の寒天(OXOID Ltd.)を加え，径90 mmの滅菌シャーレ当たり30 mLを分注して固めたものである．

2)　アミノ酸添加軟寒天培地(トップアガー)

トップアガーは，0.6 w/v%寒天粉末(Difco Laboratories)及び0.6 w/v%塩化ナトリウムの組成の軟寒天を調製し，これに，S. typhimurium用には0.5 mmol/L D-ビオチン及び0.5 mmol/L L-ヒスチジン水溶液，E. coli用には0.5 mM L-トリプトファン水溶液を1/10容量加えた．

3.　S9 mix

フェノバルビタール及び5,6-ベンゾフラボンを腹腔内投与した7週齢のSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製したS9並びに補酵素をオリエンタル酵母工業(株)から購入し，S9 mixを調製した．

4.　被験物質

1,3-ジブロモプロパン(ロット番号:07253，東ソー(株)，東京)は，純度99.8 %，比重1.9818，融点-36.2 ℃，沸点165 ℃の無色透明の液体である．使用時まで室温・遮光下で気密容器で保存した．なお，実験終了後，被験物質溶液を東ソー(株)で分析した結果，実験期間中は安定で あった．

5.　被験液の調製

本被験物質は水に難溶であったため，溶媒はジメチルスルホキシド(DMSO:試薬特級，和光純薬工業(株))を用いた．被験物質を溶媒で希釈して原液(50.0 mg/mL)を調製し，次いで順次溶媒で希釈して各濃度の被験液を調製した．

6.　試験用量の設定

濃度設定試験には，最高用量を5000 μg/plateとしてDMSOにより公比4で7段階希釈した計8濃度を用いた．培養終了後，菌株及び代謝活性化の有無にかかわらず，1250 μg/plate以上の処理群において生育阻害が観察された．一方，菌株及び代謝活性化の有無にかかわらず，全処理群において，結晶/沈殿の析出は認められなかった．

濃度設定試験の結果，試験菌株に対する生育阻害は1250 μg/plate以上で認められたため，本試験では，1250 μg/plateを最高用量として以下公比2で6段階希釈した計7濃度の用量を設定した．

7.　陽性対照物質

陽性対照物質として下記に示した5種類の物質を使用した．
AF-2:2-(2-furyl)-3-(5-nitro-2-furyl)acrylamide(和光純薬工業(株))
SAZ:Sodium azide(和光純薬工業(株))
ICR-191:2-methoxy-6-chloro-9-[3-(2-chloroethyl)-aminopropylamino]acridine・2HCl(Polysciences, Inc.)
2AA:2-aminoanthracene(ナカライテスク(株))
B[a]P:Benzo[a]pyrene(ナカライテスク(株))

AF-2，ICR-191，2AA及びB[a]PはDMSOを用いて溶解し，SAZは注射用水(日局，(株)大塚製薬工場)で溶解し，それぞれ目的濃度に調製した．

8.　試験方法

Amesらの原法1)の改良法2)であるプレインキュベーション法に準じて，非代謝活性化群及び代謝活性化群それぞれについて試験を実施した．試験管に，使用溶媒，被験液あるいは陽性対照物質溶液を100 μL，次いで非代謝活性化群の場合，0.1 Mナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)を500 μL，代謝活性化群の場合，S9 mixを500 μL添加した．さらに，試験菌液100 μLを加え，37 ℃で20分間振盪培養(プレインキュベーション)した．培養終了後，あらかじめ45 ℃に保温したトップアガーを2 mL添加し，混合液をプレート上に重層した．37 ℃で48時間培養した後，被験物質の試験菌株の生育阻害及び沈殿/結晶の析出の有無を実体顕微鏡を用いて観察した．次いで，復帰突然変異コロニー数を計測した．計数に際しては自動コロニーカウンター(バイオマルチスキャナーBMS-400，東洋測器)を用いた．各濃度につき3枚のプレートを使用した．

9.　結果判定

復帰変異コロニー数が溶媒対照のほぼ2倍以上に増加し，かつ，再現性あるいは被験物質の用量に依存性が認められた場合に，陽性と判定した．なお，判定に際しては統計学的処理は行わなかった．

結果及び考察

濃度設定試験の結果をTable 1に，本試験の結果をTable 2に示した．

濃度設定試験及び本試験のいずれにおいても，S. typhimurium TA100の代謝活性化では156 μg/plate以上，TA1535の代謝活性化では19.5 μg/plate以上の被験物質処理群において溶媒対照と比較して2倍以上の用量依存的な復帰変異コロニー数の増加が認められた．このことから，本被験物質は代謝活性化存在下において特に塩基対置換型のサルモネラ菌に対して変異を誘発する物質であることが示唆された．また，最大比活性値は，TA1535で，78.1 μg/plate(代謝活性化)において1485 revertants/mg/plateであることから，本被験物質は復帰突然変異誘発能を有することが示唆された．一方，陽性対照群では各菌株の溶媒対照群に比較して2倍以上の明らかな復帰変異コロニー数の増加が認められた．従って，供試菌株の復帰突然変異誘発物質に対する反応は適切であったことが確認された．

更に，各菌株の代謝活性化及び非代謝活性化における溶媒対照及び陽性対照の復帰変異コロニー数は当試験実施施設における背景データと比較し異常と考えられる数値が認められず，試験は適切に実施されたものと考えられた．

以上の結果から，本試験条件下において1,3-ジブロモプロパンは細菌に対して復帰突然変異誘発性を示す(陽性)と判定した．

なお，本被験物質については，Ames試験及び染色体異常試験で陽性との報告がある3)．また，類縁体の1,3-dichloropropene4)及び1-bromo-3-chloropropane5)は，Ames試験で陽性と報告があり，一方，同じ類縁体の2,4,6-tribromophenol6)及びchloropentabromocyclohexane7)は，Ames試験で陰性との報告もあった．

文献

1)D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983).
2)T. Matsushima et al., "Short-Term Test Systems for Detecting Carcinogens," eds. by K. H. Norpoth, R. C. Garner, Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 1980, pp. 273-285.
3)石館基　監修，"微生物を用いる変異原性試験データ集，"能美健彦，松井道子　編，エル・アイ・シー，東京，1991.
4)労働省労働基準局安全衛生部化学物質調査課監修，労働安全衛生法に基づく既存化学物質変異原性試験データ集，日本化学物質安全・情報センター東京，1996.
5)澁谷徹，化学物質毒性試験報告，7, 411(1999).
6)益森勝志，化学物質毒性試験報告，8, 501(2001).
7)澁谷徹，化学物質毒性試験報告，3, 103(1996).

連絡先
試験責任者：林崎　篤
試験担当者：三浦康義，望月　肇，斉藤　準，西村　進
(株)ボゾリサーチセンター
〒412-0039　静岡県御殿場市かまど1284
Tel 0550-82-2000Fax 0550-82-2379

Correspondence
Authors:Atsushi Hayashizaki(Study Director)
Yasuyoshi Miura, Hajime Mochizuki, Hitoshi Saito, Susumu Nishimura
Bozo Research Center Inc.
1284 Kamado, Gotemba-shi, Shizuoka, 412-0039, Japan
Tel +81-550-82-2000Fax +81-550-82-2379