以上の結果から,イソシアヌル酸のラットへの反復投与による主な毒性影響は腎臓および膀胱に認められ,副腎および胸腺に対する影響も認められた.無影響量は,雌雄とも150 mg/kg/dayと推定された.
したがって,雌雄親動物の生殖能および児動物の発生に対する無影響量は,いずれも600 mg/kg/dayと推定された.
投与期間中毎日,動物の生死,外観,行動等について観察した.
(2) 体重および摂餌量測定
体重の測定は,投与開始日(投与開始直前)およびその後は7日間隔で行い,さらに最終投与日と剖検日に測定した.ただし,雌の妊娠後は妊娠0,7,14および20 日と哺育0および4日に測定した.摂餌量は体重測定日に合わせて,翌日までの24時間の飼料消費量を測定した.摂餌量の最終測定は,雄は投与43日,雌は哺育3日に行った.交配期間中は摂餌量を測定しなかった.
(3) 交配および分娩状態観察
投与15日の午後に,雄のケージに同一群内の雌を入れて1対1の組み合わせを作り,交尾が確認されるまで連続同居させた.交尾の確認は毎朝一定時刻(9:30分頃)に行い,膣栓形成あるいは膣垢中に精子が確認された日を妊娠0日とした.分娩状態の観察も同じ時刻に行い,1腹全例の出産が確認された日を哺育0日とした.交配および分娩の観察結果から,各群について同居開始から交尾成立までの期間,交尾率〔(交尾動物数/同居動物数)×100〕,受胎率〔(受胎雌数/交尾雌数)×100〕および出産率〔(生児出産雌数/受胎雌数)×100〕ならびに分娩の確認された例について妊娠期間(妊娠0日から分娩が確認された日までの期間)を算定した.
(4) 雄の臨床病理学検査
尿検査:投与38日あるいは41日に腰部を刺激して新鮮尿を採取し,試験紙法(マイルス・三共(株),マルティスティックス(R))によるpH,潜血,タンパク,糖,ケトン体,ビリルビンおよびウロビリノーゲンの定性的検査を行った.また,ラットを代謝ケージに収容(2〜3 時間)して得た蓄尿について,外観の観察,比重の測定(エルマ光学株式会社,屈折計)ならびに尿沈渣の検査を行った.
血液学検査:供試血液の採取は,投与期間終了翌日における屠殺剖検時に行った.動物は採血前日の午後5時より除餌し,水のみを給与した.採取した血液は3分割し,その一部はEDTA-2Kで処理し,多項目自動血球計数装置〔東亜医用電子(株),E-4000〕により,赤血球数(電気抵抗検出方式),血色素量(ラウリル硫酸ナトリウム-ヘモグロビン法),ヘマトクリット値(パルス検出方式),平均赤血球容積,平均赤血球血色素量,平均赤血球血色素濃度(以上,計算値),白血球数および血小板数(以上,電気抵抗検出方式)を,また塗抹標本を作製して網状赤血球数(Brilliant cresyl blue 染色)を測定した.さらに,一部は3.8%クエン酸ナトリウム液で処理して血漿を得,血液凝固自動測定装置(アメルング社,KC-10A)により,プロトロンビン時間(Quick一段法)および活性化部分トロンボプラスチン時間(エラジン酸活性化法)を測定した.
血液生化学検査:採取した血液の一部から血清を分離し,生化学自動分析装置〔日本電子(株),JCA-VX-1000 型クリナライザー〕により,総タンパク(Biuret法),アルブミン(BCG 法),A/G比(計算値),グルコース,トリグリセライド,総コレステロール(以上,酵素法),総ビリルビン(Jendrassik法),尿素窒素(Urease-UV 法),クレアチニン(Jaff
法),GOT,GPT,γ-GTP(以上,SSCC 法),アルカリホスファターゼ(GSCC 法),カルシウム(OCPC 法)および無機リン(酵素法)を,また電解質自動分析装置〔東亜電波工業(株),NAKL-1〕により,ナトリウム,カリウムおよび塩素を測定した.
(5) 病理学検査
雄の計画屠殺動物は採血に続いて,雌の計画屠殺動物は哺育4日の観察終了後に,また交配不成立の雌は交配期間終了3日後に,分娩予定日を過ぎても分娩が認められない雌は分娩予定の4日後に,哺育期間中に全児が死亡した雌は死亡が確認された日に,いずれもエーテル麻酔下で放血屠殺し,脳,心臓,肝臓,腎臓,脾臓,副腎,胸腺ならびに雄についてはさらに精巣,精巣上体を秤量した.雌については,卵巣の黄体数および子宮の着床数を調べ,着床率[(着床数/黄体数)×100]を算定した.病理組織学検査は,採取した器官を10%中性リン酸緩衝ホルマリン液(精巣および精巣上体のみブアン液)で固定後,対照群および600 mg/kg群の雌雄,ならびに他の群の交配および妊娠の成立しなかった雌雄の脳,下垂体,甲状腺,上皮小体,胸腺,心臓,肺,肝臓,腎臓,副腎,脾臓,胃,小腸(十二指腸・空腸・回腸),大腸(盲腸・結腸・直腸),膵臓,膀胱,骨髄,リンパ節,さらに雄では精巣,精巣上体,前立腺,精嚢,雌では卵巣,子宮,膣,乳腺について,また 10,40 および 150 mg/kg群の妊娠が成立した動物では,600 mg/kg群で毒性影響と考えられる変化の認められた雌雄の腎臓,膀胱,副腎,雌の肝臓,胸腺について,常法に従いパラフィン切片を作製し,ヘマトキシリン・エオジン染色を施して鏡検した.また,沈着物を同定するため,一部の雌の腎臓については脂肪染色(ズダン��)も行った.
(1) 産児数および性比
分娩完了の確認後各腹の産児数(生児と死亡児の合計)を調べ,分娩率〔(総出産児数/着床数)×100〕を算定した.また,性別は肛門と生殖突起の距離の長短により判定し,群ごとの性比を算出した.
(2) 外表異常および一般状態観察
分娩完了後,口腔内を含む外表の異常を観察した.また,毎日一般状態および生死を確認し,出生率〔(出産確認時生児数/総出産児数)×100〕および新生児生存率〔(哺育4日生児数/出産確認時生児数)×100〕を求めた.
(3) 体重測定
哺育0および4日に,雌雄別に各腹ごとの総体重を測定し,1匹当たりの平均体重を算出した.
(4) 病理学検査
死亡例は発見時に,生存例は雌親の解剖時(哺育4日)にエーテル・クロロホルムで麻酔死させ,胸腹部における主要器官を肉眼的に観察した.
法(群の大きさが異なる場合)により対照群に対する各群の比較検定を行った.カテゴリカルデータは,χ^2検定を行った.なお,新生児に関するデータは,1腹当たりの平均を1標本とした.


妊娠を成立させた雄において,腎臓には10匹中全例に,ネフロン単位でび漫性の尿細管拡張が認められた.尿細管の拡張は遠位尿細管,集合管および乳頭管に認められ,近位尿細管も拡張する傾向にあった.多くの例で尿細管上皮の壊死および過形成,再生像と考えられる好塩基性尿細管の増加,間質の線維化,髄質に好中球の浸潤などを伴っており,拡張した尿細管には脱落した上皮細胞や浸潤細胞の集塊が認められた.また,皮質から皮髄境界部にかけて,鉱質沈着がみられる例もあった.膀胱には粘膜の過形成が2匹に認められ,その内の1匹の粘膜下織には好中球の浸潤が認められた.副腎では皮質束状帯細胞の空胞化が,対照群の1匹に対し6匹と増加した.分娩し哺育も順調であった雌においても,腎臓に雄と同様の変化が10匹中全例に認められたほか,近位尿細管上皮の空胞変性が8匹に認められた.また,膀胱には粘膜の過形成,副腎には束状帯細胞の空胞化がいずれも4匹に認められた.さらに,胸腺には皮質の萎縮が対照群にも2匹認られたが600 mg/kgでは5匹に認められ,発現率の増加傾向が認められたほか,600 mg/kg群の5匹中2匹の変化は,対照群の例に比べて強かった.交配不成立の40 mg/kg群の1対では雄に変化は認められず,雌には肺に出血を伴う炎症性細胞浸潤巣が認められた.妊娠不成立の10 mg/kg群の2対においては,雌の1匹に肺胞内水腫が認められたがごく軽度な変化で,その他の雌雄には異常は認められなかった.分娩後全児死亡の40および150 mg/kg群の雌各1匹では,副腎皮質束状帯細胞の空胞化が共通して認められたほか,40 mg/kg群の例で肝細胞および腎臓近位尿細管上皮の脂肪変性、腺胃粘膜のびらん、胸腺皮質の萎縮が,150 mg/kg群の例で前胃扁平上皮の過形成が認められた.雌雄の下垂体,生殖器系器官,雌の乳腺には異常は認められなかった.以上の所見以外にも変化は認められたが,用量依存性は認められなかった.

交尾は40 mg/kg群の1対を除いて各群の全例に成立し,成立に要する期間にも有意な変化は認められなかった.受胎率も10 mg/kg群は80%であったが,対照を含む他の群は全て100 %であった.
(2) 黄体数,着床数および着床率
被験物質投与各群において,黄体数,着床数および着床率は対照群と類似した値を示し,有意な変化は認められなかった.
(3) 出産率および妊娠期間
出産率は,対照群および被験物質投与各群とも100%であった.なお,150 mg/kg群の1匹は分娩確認時に全児が死亡していたが,その大部分の例の肺は吸気肺でしかも体表には咬傷が認められたことから,多くは出産後死亡あるいは食殺されたものと判断した.妊娠期間にも有意な変化は認められなかった.
(4) 分娩および哺育状態
分娩状態については,各群のいずれの動物にも異常は認められなかった.哺育状態についても,前述の分娩直後に全児が死亡あるいは食殺されたと思われる150 mg/kg群の1匹および哺育3日までに全児が死亡した40 mg/kg群の1匹が認められたが,用量依存的な変化ではなく,被験物質の投与の影響を示唆する異常は認められなかった.
被験物質投与各群の1腹当たりの総出産児数,新生児数,出生率,性比,哺育0日の体重ならびに哺育4日の生存率および体重には,いずれも対照群と比べて有意な変化が認められず,新生児の一般状態にも異常は認められなかった.
(2) 形態
外表異常について,痕跡尾が対照群および150 mg/kg群の各1匹に認められたが,被験物質の投与に起因すると考えられる異常は認められなかった.内臓異常はいずれの児動物にも認められなかった.内臓変異についても,胸腺の頚部遺残,左臍動脈遺残あるいは腎盂の拡張が総計対照群で5匹(3.1%)に対し被験物質投与各群で2〜6 匹(1.7〜4.2%)の範囲で,有意な変化は認められなかった.
すなわち,600 mg/kg群で,腎臓においては,剖検で腫大,退色および重量の増加が認められた.組織学的には,尿細管上皮の壊死,脱落およびそれによる尿の停滞を示唆する尿細管の拡張を特徴とする変化であった.
腎臓および膀胱の組織標本では結晶物質の存在は確認できなかったが,尿中には析出した被験物質と思われる結晶物質が認められた.Cascieriら5)はシアヌル酸ナトリウムのラットおよびマウスへの投与により発現する腎障害は,腎臓で析出したイソシアヌル酸の結晶による物理的な影響によることを報告している.本試験において認められた腎臓および膀胱の変化も,尿細管内で水分の再吸収に伴って析出した被験物質の結晶が起炎物質として作用して発現したものと推察される.類似した変化はサルファ剤,メチシリンなどでも報告されている6).また,膀胱においても,刺激に対する反応性増殖と考えられる粘膜上皮の過形成が認められたが,変化は腎臓に比べて軽度なものであった.
雌雄の親動物で認められた赤色尿の排泄,雄親の検査で認められた尿沈渣中赤血球および白血球の増加,血液尿素窒素およびクレアチニンの増加,ナトリウムの減少は,いずれも主に腎臓の変化と関連する所見と考えられる.また,雄親の貧血所見も,骨髄および脾臓に造血能に対する影響や赤血球破壊亢進を示唆する変化が認められなかったことから,障害されたおそらく腎臓からの出血によるものと推察される.
雌雄の親動物とも,副腎の退色および相対重量の増加が認められ,皮質束状帯細胞に脂質の増加を示唆する空胞化が組織学的に観察された.また,雌親では胸腺皮質の萎縮する例が増加する傾向にあった.副腎および胸腺の変化は,イソシアヌル酸の毒性影響に対するストレスと関連した二次的な変化と判断される.
これらの変化に加えて,雄親では体重増加の抑制が,雌親においても体重の平均値では有意な変化は認められなかったものの削痩する例が認められた.
なお,最終体重が対照群と比べて小さかった600 mg/kg群で,雄は下垂体および脾臓,雌は脳のいずれも相対重量が増加し,下垂体重量の変化は150 mg/kg群の雄にも認められたが,これらの器官に病理組織学的変化は認められなかった.したがって,下垂体,脾臓および脳の重量変化は主に体重の変化に伴う所見で,毒性影響を示唆する変化ではないと判断された.
以上の結果から,イソシアヌル酸のラットへの反復投与による主な毒性影響は腎臓および膀胱に認められ,副腎および胸腺に対する影響も認められた.無影響量は雌雄とも150 mg/kg/dayと推定された.
交配および妊娠の不成立の対,分娩後全児が死亡した雌親が投与量とは無関係に散発したが,いずれにも生殖能の異常を示唆する病理学的な異常は認められず,偶発的な変化と考えられた.
以上の結果から,雌雄親動物の生殖能および児動物の発生に対する影響は600 mg/kg/day投与によっても認められず,無影響量はいずれも600 mg/kg/dayと推定された.
| 1) | Canelli, Amer. J. Public Health, 64, 155(1974). |
| 2) | N. Inokuchi, R. Sawamura, A. Hasegawa and G. Urakubo, Eisei Kagaku, 24(1), 49(1978). |
| 3) | B. G. Hammond, S. J. Barbee, T. Inoue,N. Ishida,G. J. Levinskas, M. W. stevens, A. G. Wheeler and T. Cascieri, Environ. Health Persect., 69, 287(1986). |
| 4) | L. M. Allen, T. V. Briggle and C. D. Pfaffenberger, Drug Metab. Reviews, 13(3), 499(1982). |
| 5) | T. Cascieri, S. Barbee, B. Hammond, T. Inoue, N. Ishida and A. Wheeler, Toxicologist, 5, 58(1985). |
| 6) | 渡辺満利,"毒性試験講座 5-毒性病理学," 前川 昭彦,林 裕造 編,地人書館,東京,1991,pp.267-293. |
| 連絡先 | |||
| 試験責任者: | 伊藤義彦 | ||
| 試験担当者: | 野田 篤,下平裕二,伊藤雅也,迫川朋子,昆 尚美 | ||
| (財)畜産生物科学安全研究所 | |||
| 〒229-11 神奈川県相模原市橋本台3-7-11 | |||
| Tel 0427-62-2775 | Fax 0427-62-7979 | ||
| Correspondence | ||||
| Authors: | Yoshihiko Ito(Study director) Atsushi Noda,Yuji Shimodaira,Masaya Ito,Tomoko Sakogawa, Naomi Kon | |||
| Research Institute for Animal Science in Biochemistry and Toxicology | ||||
| 3-7-11 Hashimotodai, Sagamihara-shi, Kanagawa, 229-11 Japan | ||||
| Tel +81-427-62-2775 | Fax +81-427-62-7979 | |||