1,3,5-トリヒドロキシベンゼンのチャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる
染色体異常試験

In Vitro Chromosomal Aberration Test of 1,3,5-Trihydroxybenzene
in Cultured Chinese Hamster Cells

要約

1,3,5-トリヒドロキシベンゼンの培養細胞に及ぼす細胞遺伝学的影響について，チャイニーズ・ハムスター培養細胞(CHL/IU)を用いて染色体異常試験を実施した．

連続処理(24時間)における50 %細胞増殖抑制濃度は，0.90 mg/mLであった．S9 mix非存在下および存在下の短時間処理(6時間)では，1.3 mg/mL(10 mmol/L)の濃度においても50 %を越える細胞増殖抑制は認められなかった．従って，すべての処理群で1.3 mg/mL(10 mmol/L)を最高濃度とし，公比2で4〜5濃度設定した．連続処理では，24時間処理後，短時間処理ではS9 mix非存在下および存在下で6時間処理し，新鮮培地で更に18時間培養後，標本を作製し，検鏡することにより染色体異常誘発性を検討した．染色体分析が可能な最高濃度は，24時間連続処理およびS9 mix存在下の短時間処理では0.33 mg/mL，S9 mix非存在下での短時間処理では1.3 mg/mL(10 mmol/L)であったことから，これらの濃度を高濃度群として3濃度群を観察対象とした．

CHL/IU細胞を24時間連続処理した群では，中濃度(0.16 mg/mL)および高濃度(0.33 mg/mL)で染色体異常の誘発作用が認められ，その出現頻度は8.5 %および12.0 %(gapを除く)であった．一方，倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．S9 mix非存在下の短時間処理では，高濃度(1.3 mg/mL)で，染色体異常および倍数性細胞の誘発作用が認められ，その出現頻度はそれぞれ13.5 %(gapを除く)および4.13 %であった．S9 mix存在下の短時間処理では，高濃度(0.33 mg/mL)で，染色体異常の誘発作用が認められ，その出現頻度は3.5 %(gapを除く)であった．しかしながら，出現頻度が低頻度であったことから陰性と判定した．倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．

以上の結果より，本試験条件下で1,3,5-トリヒドロキシベンゼンは，染色体異常を誘発する(陽性)と結論した．

方法

1.　使用した細胞

リサーチ・リソースバンク(JCRB)から入手(1988年2月，入手時:継代4代，現在21代)したチャイニーズ・ハムスター由来のCHL/IU細胞を，解凍後継代10代以内で試験に用いた．

2.　培養液の調製

培養には，仔牛血清(CS，Cansera International)を10 vol%添加したイーグルMEM(日水製薬(株))培養液を用いた．

3.　培養条件

2 × 104個のCHL/IU細胞を，培養液5 mLを入れたディッシュ(径6 cm，Corning)に播き，37 ℃のCO2インキュベーター(5 % CO2)内で培養した．連続処理では，細胞播種3日目に新鮮培地と交換後，被験物質を加え，24時間処理した．また，短時間処理では，細胞播種3日目にS9 mix非存在下および存在下で6時間処理し，処理終了後新鮮な培養液でさらに18時間培養した．

4.　S9

S9(キッコーマン(株))は，フェノバルビタールと5,6-ベンゾフラボンを投与した雄Sprague-Dawley系ラットの肝臓から調製したものを購入した．添加量は培地に対して5 vol%とした．

5.　被験物質

1,3,5-トリヒドロキシベンゼン(ロット番号:0S-12074，石原産業(株)(大阪))は，白色粉末で，水に対して16 mg/mL以上50 mg/mL未満，アセトンおよびDMSOに対しては50 mg/mL以上の溶解性を示し，融点218 ℃，純度100 %(無水換算，水分0.09 %を含む)の物質で，通常の取り扱い条件では安定であり，室温で保管した．被験物質原体は，室温で安定であった．

6.　被験物質の調製

被験物質は用時調製して試験に用いた．溶媒は局方注射用水(ロット番号:K8L76およびK9K79，(株)大塚製薬工場)を用いた．原体を溶媒に溶解して原液を調製し，ついで原液を溶媒で順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を作製した．被験物質調製液は，すべての試験において培養液の10 vol%になるように加えた．

7.　細胞増殖抑制試験

染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため，被験物質の細胞増殖に及ぼす影響を調べた．被験物質のCHL/IU細胞に対する増殖抑制作用は，単層培養細胞密度計(MonocellaterTM，オリンパス光学工業(株))を用いて各群の増殖度を計測し，被験物質処理群の溶媒対照群に対する細胞増殖の比をもって指標とした．その結果，連続処理における50 %細胞増殖抑制濃度は0.90 mg/mLであった．S9 mix非存在下および存在下の短時間処理では，最高処理濃度の1.3 mg/mL(10 mmol/L)の濃度においても50 %を越える細胞増殖抑制は認められなかった(Fig. 1)．

8.　実験群の設定

細胞増殖抑制試験の結果より，染色体異常試験で用いる被験物質の高濃度群を，すべての処理群において1.3 mg/mL(10 mmol/L)を最高処理濃度とし，公比2で4〜5濃度を設定した(連続処理:0.081，0.16，0.33，0.65，1.3 mg/mL，S9 mix非存在下および存在下の短時間処理:0.16，0.33，0.65，1.3 mg/mL)．S9 mix存在下の短時間処理では，毒性のために3濃度群が得られなかったので，1.3 mg/mL(10 mmol/L)を最高処理濃度とし，公比2で5濃度(0.081，0.16，0.33，0.65，1.3 mg/mL)を設定して再試験を行った．

陽性対照物質として用いたマイトマイシンC(MC，協和醗酵工業(株))およびシクロホスファミド(CPA，Sigma Chemical Co.)は，局方注射用水((株)大塚製薬工場)に溶解して調製した．それぞれ染色体異常を誘発することが知られている濃度を適用した．

染色体異常試験において，溶媒対照群と処理群では1濃度あたり4枚のディッシュを用い，そのうちの2枚は染色体標本を作製し，別の2枚については単層培養細胞密度計により細胞増殖率を測定した．無処理対照群および陽性対照群については細胞増殖率測定は行わなかった．

9.　染色体標本作製法

培養終了の2時間前に，コルセミドを最終濃度が約0.1 μg/mLになるように培養液に加えた．染色体標本の作製は常法に従って行った．スライド標本は各ディッシュにつき6枚作製した．作製した標本を3 vol%ギムザ溶液で染色した．

10.　染色体分析

細胞増殖率測定の結果と分裂指数により，20 %以上の相対増殖率で，かつ2ディッシュともに0.5 %以上の分裂指数を示した最も高い濃度を観察対象の最高濃度群とし，観察対象の3濃度群を決定した．その結果(Table 1〜3)，24時間連続処理およびS9 mix存在下の短時間処理では0.33 mg/mL，S9 mix非存在下での短時間処理では1.3 mg/mL(10 mmol/L)が観察可能な最高濃度であったことから，これらの濃度を高濃度群として3濃度群を観察対象とした．

作製したスライド標本のうち，1つのディッシュから得られた異なるスライドを，4名の観察者がそれぞれ処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した．染色体の分析は，日本環境変異原学会・哺乳動物試験研究会(MMS)1)による分類法に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型のギャップ，切断，交換などの構造異常の有無と倍数性細胞(polyploid)の有無について観察した．また構造異常については1群200個，倍数性細胞については1群800個の分裂中期細胞を分析した．

11.　記録と判定

無処理対照，溶媒および陽性対照群と被験物質処理群についての分析結果は，観察した細胞数，構造異常の種類と数，倍数性細胞の数について集計し，各群の値を記録用紙に記入した．

染色体異常を有する細胞の出現頻度について，溶媒対照群と被験物質処理群および陽性対照群間でフィッシャーの直接確率法2)により，有意差検定を実施した(p<0.01)．また，用量依存性に関してコクラン・アーミテッジの傾向性検定3)(p<0.01)を行った．これらの検定結果を参考とし，生物学的な観点からの判断を加味して染色体異常誘発性の評価を行った．

結果および考察

連続処理による染色体分析の結果をTable 1に示した．1,3,5-トリヒドロキシベンゼンを加えて24時間連続処理した群では，中濃度(0.16 mg/mL)および高濃度(0.33 mg/mL)で染色体異常の誘発作用が認められ，その出現頻度は8.5 %および12.0 %(gapを除く)であった．一方，倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．

短時間処理による染色体分析の結果をTable 2および3に示した．S9 mix非存在下の短時間処理では，高濃度(1.3 mg/mL)で，染色体異常および倍数性細胞の誘発作用が認められ，その出現頻度はそれぞれ13.5 %(gapを除く)および4.13 %であった．S9 mix存在下の短時間処理では，高濃度(0.33 mg/mL)で，染色体異常の誘発作用が認められ，その出現頻度は3.5 %(gapを除く)であった．しかしながら，出現頻度が低頻度であったことから陰性と判定した．倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．

染色体の構造異常の誘発が認められたS9 mix非存在下の短時間処理群および連続処理群について，D20値4)を求めたところ，それぞれ2.0 mg/mLおよび0.54 mg/mLとなった。また，倍数性細胞陽性となったS9 mix非存在下の短時間処理群におけるD20値は6.4 mg/mLとなった。

3つの水酸基の結合位置のみが異るpyrogallol(1,2,3-benzenetriol)や水酸基が3つではなく2つ結合したhydroquinone(1,4-benzenediol)については，タマネギを用いた染色体異常試験で陽性の結果が得られている5)。一方，フェノールについては，タマネギを用いた染色体異常試験では陰性の結果が得られており5)，フェノールに水酸基が結合することにより染色体異常を誘発することが示唆された。

陽性対照物質として用いたMCは，S9 mix非存在下で短時間処理および24時間連続処理した場合において染色体の構造異常を誘発し(Table 1, 3)，CPAはS9 mix存在下で短時間処理した場合において染色体の構造異常を誘発した(Table 2)．これらの陽性対照物質の結果より，本実験系の成立が確認された．

従って，1,3,5-トリヒドロキシベンゼンは，上記の試験条件下で，試験管内のCHL/IU細胞に染色体異常を誘発すると結論した．

文献

1)日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編，"化学物質による染色体異常アトラス，"朝倉書店，東京，1988, pp. 16-37.
2)吉村功編，"毒性・薬効データの統計解析，事例研究によるアプローチ，"サイエンティスト社，東京，1987, pp. 76-78.
3)吉村功，大橋靖夫編集，"毒性試験講座14，毒性試験データの統計解析，"地人書館，東京，1992.
4)石館基監修，"<改定>染色体異常試験データ集，"エル・アイ・シー，東京, 1987.
5)賀田恒夫，石館基監修，"環境変異原性データ集1，"サイエンティスト社，東京，1980, p353, p215, p329.

連絡先
試験責任者：田中憲穂
試験担当者：山影康次，高橋俊孝，若栗　忍，渡辺美香，中川ゆづき，橋本恵子，三枝克彦，加藤初美
(財)食品薬品安全センター秦野研究所
〒257-8523　神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Noriho Tanaka (Study director)
Kohji Yamakage, Toshitaka Takahasi,Shinobu Wakuri, Mika Watanabe,Yuzuki Nakagawa, Keiko Hashimoto,Katsuhiko Saegusa, Hatsumi Kato
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano, Kanagawa, 257-8523, Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627