一般状態の観察では,360 mg/kg群において,雌雄の多数例でチアノーゼ,皮膚蒼白および流涎が認められ,雄または雌の少数ないし半数例で眼球突出あるいはよろめき歩行が認められた.これらの症状のうちチアノーゼおよび皮膚蒼白は継続的にみられた変化であったが,流涎は投与直後に一過性にみられた変化であり,眼球突出およびよろめき歩行も投与後6時間までには消失する変化であった.
体重では,360 mg/kg群の雌雄で増加抑制が認められ,同群では摂餌量が雄では投与期間を通して減少し,雌では投与1週目に減少した.
尿検査では,360 mg/kg群の雌雄で尿量の増加,ナトリウム,カリウムおよびクロール排泄量の増加ならびに浸透圧および比重の減少が認められた.
血液学検査では,60および360 mg/kg群の雌雄でメトヘモグロビンの増加,赤血球数,ヘモグロビン量およびヘマトクリット値の減少ならびに網状赤血球率の増加が認められた.さらに,360 mg/kg群では,雌雄で白血球数の増加,雄で好中球比の増加,雌で活性化部分トロンボプラスチン時間の短縮が認められた.
血液生化学検査では,360 mg/kg群の雌雄で総ビリルビン,GOT,GPT,リン脂質および無機リンの増加が認められ,さらに同群の雄ではカリウムおよびクロールの減少,雌では総コレステロールおよびカルシウムの増加が認められた.
器官重量では,60および360 mg/kg群の雌雄で脾臓の絶対および相対重量の増加が認められた.さらに,360 mg/kg群では,雌雄で甲状腺,肝臓および腎臓の絶対および相対重量の増加が認められたほか,精巣の絶対および相対重量にも増加が認められた.
病理組織学検査では,60および360 mg/kg群の雌雄で肝臓および脾臓のヘモジデリン沈着および脾臓の髄外造血が認められ,さらに,360 mg/kg群の雌雄で腎臓のヘモジデリン沈着および肝臓の髄外造血が認められた.また,肝臓の肝細胞の肥大および甲状腺の濾胞上皮の肥大が60 mg/kg群の雄および360 mg/kg群の雌雄に認められ,腎臓では乳頭間質の壊死が360 mg/kg群の雌雄に,近位尿細管上皮の硝子滴が360 mg/kg群の雄に認められた.
回復試験では,投与期間中にみられた変化のうち,腎臓での乳頭間質の壊死ならびに肝臓,脾臓および腎臓でのヘモジデリン沈着が認められたが,そのほかの変化については消失するか回復する傾向が認められた.
以上の結果から,本試験条件下における無影響量は雌雄とも10 mg/kg/dayと考えられた.
投与経路は経口とし,胃管を用いた強制投与を1日1回,28日間反復して行った.投与容量は5 ml/kgとし,個体ごとに最新の体重を基に算出した.
試験群は,上記3用量に,コーンオイルを投与する対照を加え計4群とした.1群当たりの動物数は,投与期間終了時の剖検例として各群とも雌雄各6匹,さらに,対照群および360 mg/kg群には14日間の回復期間終了時の剖検例として雌雄各6匹を設けた.群分けは,投与開始前日の体重を基に層別連続無作為化法で行った.
nwald-Giemsa染色を施して白血球百分比を,ニューメチレンブルー超生体染色を施して網状赤血球率を視算した.また,ヘパリン処理血液を用いて,メトヘモグロビン(シアンメトヘモグロビン法)をダブルビーム分光光度計(U-2000,(株)日立製作所)により測定した.さらに,3.8%クエン酸ナトリウム加血液を3000回転/分で15分間遠心分離し,得られた血漿を用いて全自動血液凝固測定装置(Sysmex CA-5000,東亜医用電子(株))により,プロトロンビン時間(散乱光検出方式)および活性化部分トロンボプラスチン時間(散乱光検出方式)を測定した.
lewski-La Due法),γ-グルタミルトランスペプチダーゼ(L-γ-グルタミル-DBHA基質法),アルカリ性フォスファターゼ(p-ニトロフェニルリン酸基質法),総コレステロール(COD-DAOS法),トリグリセライド(GPO-DAOS法・グリセリン消去法),リン脂質(酵素法・DAOS発色法),グルコース(グルコキナーゼ・G-6-PDH法),尿素窒素(ウレアーゼ-GlDH法),クレアチニン(Jaff
法),無機リン(モリブデン酸直接法)およびカルシウム(OCPC法)を測定した.また,電解質分析装置(PVA-α�掘�(株)アナリティカル・インスツルメンツ)によりナトリウム(電極法),カリウム(電極法)およびクロール(電量滴定法)を測定した.
投与期間終了時の対照群および高用量群の脳,眼球,唾液腺(顎下腺,舌下腺および耳下腺),甲状腺(上皮小体を含む),心臓,肺(気管支を含む),胸腺,肝臓,脾臓,腎臓,副腎,精巣,卵巣および骨髄(胸骨および大腿骨)については,常法に従ってパラフィン切片を作製し,ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色を施して光学顕微鏡下で観察した.さらに,甲状腺,肝臓,脾臓,腎臓および骨髄では,被験物質投与に関連したと考えられる変化が高用量群で認められたため,投与期間終了時には順次低い用量群まで,また,回復期間終了時には対照群および高用量群について同様に観察した.また,肉眼的異常部位についても病理組織学検査を実施した.なお,肝臓,脾臓および腎臓では褐色色素沈着が認められたため,ヘモジデリンの証明にベルリン青染色を行い,さらに腎臓についてはシュモール反応およびPAS染色も行った.
360 mg/kg群では,チアノーゼ,皮膚蒼白,流涎,眼球突出,よろめき歩行および軟便とこれに伴う下腹部汚染が認められた.チアノーゼは雌雄で投与3日からみられ始め,投与2週からはチアノーゼを示していた例に皮膚蒼白もみられるようになり,チアノーゼまたは皮膚蒼白は雌雄の多数例で投与期間中に継続して観察された.流涎は投与6日から投与期間終了時まで雌雄の多数例でみられ,投与直後から発現し,投与後10分までには消失する一過性の変化であった.眼球突出は,雌では6例で投与2週目から投与期間終了時までみられたが,雄では1例で投与3週目に1回みられたにすぎなかった.本症状は投与後5ないし10分から発現し,投与後6時間以内にはほとんどの例で消失した.よろめき歩行は,眼球突出が認められた例のうち雌1例で,投与2週目に1回,投与後10分からみられたが,投与後4時間30分までには消失した.また,軟便は雄2例で投与1週目に1回みられ,これに伴い下腹部汚染もみられた.回復期間では,投与期間中にみられたチアノーゼおよび皮膚蒼白が回復期間の初期には認められたが,これらの症状は回復期間中に消失し,そのほかに変化は認められなかった.
回復2週目の検査では,360 mg/kg群の雌雄で明らかな変化は認められなかった.
回復期間終了時の検査では,投与期間終了時と同様な変化として360 mg/kg群の雌雄で赤血球数の減少ならびにMCVおよびMCHの増加とMCHCの減少がみられたが,その程度は投与期間終了時より軽減しており,回復傾向が認められた.また,360 mg/kg群では,雌雄でヘモグロビン量およびヘマトクリット値の増加,雄でメトヘモグロビンの減少がみられたが,これらについては投与期間終了時とは逆の変動を示しており,回復性の変化とみなされた.そのほか,投与期間終了時にはみられなかった変化として,360 mg/kg群の雌雄で血小板数の減少が認められた.また,360 mg/kg群の雌では,好酸球比および分葉核好中球比の減少ならびにリンパ球比の増加がみられたが,投与期間終了時には対照群と差はなく,その値と回復期間終了時を比べても明らかな差はなかった.
回復期間終了時の検査では,360 mg/kg群の雌雄でカリウムの減少がみられたが,雄の値は投与期間終了時より軽減しており,回復傾向が認められた.そのほか,360 mg/kg群の雄でGOT,グルコースおよびクレアチニンの減少がみられたが,いずれも軽度な変化で毒性学的に意義のない変化であった.
回復期間終了時の検査では,脾臓の肥大が360 mg/kg群の雄3例と雌1例に認められた.そのほか,精巣上体(左側)の黄白色点が360 mg/kg群の1例に認められた.
回復期間終了時の検査では,投与期間終了時と同様に360 mg/kg群の雌雄で脾臓の絶対および相対重量の増加,同群の雌で肝臓の絶対および相対重量の増加が認められたが,いずれも変化の程度は投与期間終了時と比べて軽減しており,回復傾向が認められた.そのほか,360 mg/kg群の雄では脳の絶対重量の減少が認められた.
回復期間終了時の剖検例において,投与期間終了時と同様な変化として,肝臓では小葉中心性の肝細胞肥大が360 mg/kg群の雄3例に,類洞内細胞のヘモジデリン沈着が雌雄全例に認められた.脾臓では,赤脾髄でヘモジデリン沈着が360 mg/kg群の雌雄全例に認められた.腎臓では,近位尿細管上皮のヘモジデリン沈着が360 mg/kg群の雌雄全例に,近位尿細管上皮の硝子滴が360 mg/kg群の雄3例に,乳頭間質の壊死が360 mg/kg群の雄4例と雌全例に認められた.これらの変化のうち,肝臓の肝細胞肥大および腎臓の近位尿細管上皮の硝子滴については,発生例数は投与期間終了時より減少した.さらに,投与期間終了時に変化がみられた骨髄およ甲状腺では変化は認められなかった.そのほか,360 mg/kg群の雄1例では肝臓で肝細胞の単細胞壊死と肝細胞の分裂像の増加が認められ,同群の別の雄1例では肉眼的に精巣上体の黄白色点がみられた部位で精子肉芽腫が認められた.
3,5-ジメチルアニリン投与による死亡はいずれの群にもなかった.一般状態の観察では,360 mg/kg群の雌雄の多数例でチアノーゼ,皮膚蒼白および流涎が,雌雄の少数ないし半数例で眼球突出およびよろめき歩行が認められた.アニリン系化合物では,共通した毒性としてメトヘモグロビン血症と貧血が生じる3)ことが知られており,本試験でもメトヘモグロビンの増加および貧血が認められたことから,チアノーゼおよび皮膚蒼白はこれらに起因したものと考えられた.流涎については,異性体である3,4-ジメチルアニリン2)の投与でも生じており,被験物質投与に関連した変化であると考えられたが,投与直後に一過性にみられた変化であり,唾液腺に器質的な変化は認められなかった.眼球突出については,その発現機序は明らかでなかったが,投与後5ないし10分から発現し,投与後6時間までに消失する急性症状で,病理組織学的検査では眼球に対する影響は認められなかった.よろめき歩行は,雌1例で単発的にみられた変化ではあったが,眼球突出と同時に発現したものであり,被験物質投与に関連した変化と考えられた.そのほか,360 mg/kg群の雄の少数例では軟便とこれに伴う下腹部汚染がみられた.しかし,軟便は単発的な変化であり,被験物質投与による消化管等への影響は認められていないことから,媒体に用いたコーン油に起因した変化と思われた.
体重では,360 mg/kg群の雌雄で増加抑制が認められ,同群では摂餌量の減少が雄では投与期間を通して,雌では投与1週目に認められた.
尿検査では,360 mg/kg群の雌雄で尿量の増加,比重および浸透圧の減少,ならびにナトリウム,カリウムおよびクロール排泄量の増加がみられた.さらに,同群では腎臓の重量増加と乳頭間質の壊死が雌雄に,血清カリウムおよびクロールの減少ならびに蛋白質の再吸収像と考えられる尿細管上皮の硝子滴が雄に認められたことから,被験物質が腎臓に影響を及ぼしたことが示唆された.
血液学検査では,60および360 mg/kg群の雌雄でメトヘモグロビンが増加した.また,同群の雌雄では赤血球数,ヘモグロビン量およびヘマトクリット値が減少し,貧血が認められた.赤血球恒数では,MCVおよびMCHは増加を,MCHCは減少を示していることから大球性貧血であり,360 mg/kg群では血清ビリルビンも増加したことから,貧血はメトヘモグロビン形成に起因する溶血によるものと考えられた.溶血に関連する変化として,肝臓および脾臓のヘモジデリン沈着が60および360 mg/kg群の雌雄に,腎臓のヘモジデリン沈着が360 mg/kg群の雌雄に認められた.360 mg/kg群の雌雄でみられた血清GOTおよびGPTの増加についても,肝臓でこれらの逸脱酸素が増加するような病変がみられていないことから,溶血に関連した変化と考えられた.また,貧血に対する代償性の変化として,60および360 mg/kg群の雌雄では末梢血の網状赤血球率が増加し,赤芽球系を主体とする脾臓での髄外造血が60および360 mg/kg群の雌雄に,肝臓での髄外造血が360 mg/kg群の雌雄に認められ,骨髄でも造血亢進が60 mg/kg群の雄および360 mg/kg群の雌雄に認められた.また,60および360 mg/kg群の雌雄でみられた脾臓重量の増加および360 mg/kg群の雌雄でみられた肝臓重量の増加も髄外造血に伴った変化と考えられたが,肝臓については後述する肝細胞の肥大も重量の増加に影響を与えたものと思われた.このほか,血液学検査では,360 mg/kg群の雌雄で白血球数の増加が,同群の雄で好中球比の増加が認められたほか, 360 mg/kg群の雌で活性化部分トロンボプラスチン時間の短縮が認められた.白血球の増加について,その機序は明らかではないが,同群では炎症性病変はみられていないことから,赤芽球系の造血亢進に伴って,顆粒球系の造血も亢進したのではないかと思われた.一方,活性化部分トロンボプラスチン時間については,延長した場合は肝障害等の指標となるが,短縮した場合の臨床的意義は明らかではない.
上述のほか,血液生化学検査では,リン脂質の増加および無機リンの増加が360 mg/kg群の雌雄に,総コレステロールおよびカルシウムの増加が360 mg/kg群の雌に認められた.また,リン脂質および総コレステロールの変動と関連が深い肝臓では小葉中心性の肝細胞肥大が,無機リンおよびカルシウムの変動と関連が深い甲状腺では濾胞細胞の肥大と重量増加がいずれも60 mg/kg群の雄および360 mg/kg群の雌雄に認められたことから,被験物質投与が肝臓および甲状腺に影響を及ぼしたことが示唆された.なお,甲状腺の濾胞細胞の肥大については,甲状腺に被験物質が直接的に影響を及ぼした可能性があるほかに,本試験では小葉中心性の肝細胞肥大が認められていることから,その原因の1つとして,薬物代謝酵素の誘導4)が考えられ,薬物代謝酵素が誘導されたことに伴い,甲状腺ホルモンの肝臓での分解が促進し,甲状腺機能が亢進してその結果として濾胞細胞が肥大5)したようにも考えられた.
そのほか,本試験では精巣重量の増加が360 mg/kg群で認められたが,病理組織学検査では変化が認められなかったことから,毒性学的意義は低いものと考えられた.また,360 mg/kg群の雌1例では,病理学検査で,肉眼的に肝臓の黄白色点がみられた部位に広範性壊死が認められたが,他に関連する変化がないことに加え,発生例数も少なく,同様な変化は同系統のラットでは時折みられることから偶発所見と考えられた.
回復試験では,360 mg/kg群の雌雄で腎臓での乳頭間質の壊死ならびに肝臓,脾臓および腎臓でのヘモジデリン沈着が認められたが,そのほかに投与期間中にみられた変化については消失するか,軽減する傾向がみられた.ヘモジデリンの沈着については,溶血に関連する他の変化は回復していることから,回復に時間は要するものの,徐々に消失して行く変化であろうと推測される.また,腎臓での乳頭間質の壊死については,投与期間終了時と比較して回復期間終了後に変化の程度が増強するものではなかった.なお,回復試験において投与期間終了時には変化がみられなかった項目で統計学的に有意な差が認められたり,病理組織学検査で発生頻度の低い変化がみられたりしたが,いずれも他に関連する変化はないことから,被験物質投与との関連性はないものと考えられた.
以上のように,本試験では主たる変化として,雌雄とも60 mg/kg以上でメトヘモグロビンの増加とこれに伴う貧血が認められたことから,無影響量は雌雄とも10 mg/kg/dayと考えられた.
| 1) | M. Kornreich and C.A. Montgomery, Jr., "Toxicology and carcinogenesis studies of 2,6-xylidine(2,6-dimethylaniline)in Charles River CD rats," National Toxicology Program, Technical Report Series No.287(1990). |
| 2) | 井上博之,化学物質毒性試験報告,3,143(1996). |
| 3) | 竹内康浩,“毒性試験講座18,産業化学物質,環境化学物質”和田 攻編,地人書館,東京,1991,pp. 129-151. |
| 4) | J.R. Glaister, "Principles of toxicological pathology," Taylar & Francis, London and Philadelphia, 1986, pp.83-85. |
| 5) | C. Gopinath, D.E. Prentice and D.J. Lewis, "Atlas of experimental toxicological pathology," MTP Press Limited, Lancaster, 1987, pp.112-113. |
| 連絡先 | |||
| 試験責任者: | 末武和己 | ||
| 試験担当者: | 緒方英博,古川浩美,幸 邦憲,永井憲児, 神谷光一,一鬼 勉,鍬先恵美子 | ||
| パナファーム・ラボラトリーズ 安全性研究所 | |||
| 〒869-04 熊本県宇土市栗崎町1285 | |||
| Tel 0964-23-5111 | Fax 0964-23-2282 | ||
| Correspondence | ||||
| Authors: | Kazumi Suetake(Study director) Hidehiro Ogata,Hiromi Furukawa, Kuninori Yuki,Kenji Nagai, Kouichi Kamiya,Tsutomu Ichiki, Emiko Kuwasaki | |||
| Safety Assessment Laboratory, Panapharm Laboratories Co., Ltd. | ||||
| 1285 Kurisaki-machi, Uto-shi, Kumamoto, 869-04, Japan | ||||
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