トリメチルシラノールのラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of Trimethylsilanol in Rats

要約

トリメチルシラノールは，BSTFA(N,O-ビストリメチルシリルトリフロロアセトアミド)の水中変化物として知られている．また，トリメチルシラノールの一部は脱水縮合して2量化し，ヘキサメチルジシロキサンを生成すると推定されている．今回，既存化学物質の安全点検に関わる毒性調査事業の一環として，トリメチルシラノールについてSD系のラットを用い，0，10，40，160および640 mg/kgの用量で28日間反復経口投与毒性試験を実施した．なお，対照群および640 mg/kg群にはそれぞれ雌雄各5匹の14日間回復群を設けた．

一般状態の観察では，雌雄の640 mg/kg群で自発運動低下およびよろめき歩行が認められ，さらに雄で歩行困難が認められた．投与期間に観察された上述の症状は，回復期間には観察されず，症状の回復が認められた．なお，雌雄いずれの群にも死亡例は観察されなかった．

体重は雌雄の640 mg/kg群で低値傾向が認められた．摂餌量の測定では，雌雄とも変化は認められなかった．回復期間中は，雄の体重変化を除き回復が認められた．

血液学検査では，雌雄とも被験物質投与と関連づけられる変化は認められなかった．

血液凝固能検査では，雌雄の640 mg/kg群でフィブリノーゲンの高値が認められたが，回復期間終了時には雌雄とも対照群と640 mg/kg群で差は認められなかった．

血液生化学および尿検査では，雌雄とも被験物質投与の影響は認められなかった．

器官重量測定では，雌の640 mg/kg群で胸腺実重量の低値および肝臓相対重量の高値が認められたが，回復期間終了時には，肝臓の変化を除き回復が認められた．

病理学検査の結果，被験物質投与の影響が示唆される病変は観察されなかった．

以上の結果から，トリメチルシラノールの無影響量(NOEL)は雌雄とも160 mg/kg/dayと判断された．

方法

1.　被験物質

トリメチルシラノール(信越化学工業，Lot No. 702906，純度99.8 %，分子量90.20)は無色透明の液体で，沸点98〜99℃，融点-9.8℃の化合物である．被験物質は，使用時まで冷蔵，遮光，気密の条件下で保管された．なお，本ロットは投与期間中安定であることが確認された．

2.　供試動物

供試したラット［Crj:CD(SD)系，SPF］は日本チャールス・リバーから4週齢で購入した．動物を検収後，試験環境に9日間馴化させた後，6週齢で投与を開始した．動物はあらかじめ体重によって層別化し，無作為抽出法により各試験群を構成するように群分けした．投与開始時の体重は雄で142〜157 g，雌で 118〜135 gであった．

3.　飼育条件

動物はバリアシステムの飼育室で飼育し，環境調節の目標値は温度23±2℃，相対湿度55±10 %，換気回数20回/時，照明150〜300 lux，12時間(午前7時点灯，午後7時消灯)とした．水洗式飼育機を使用し，金属製前面・床網目飼育ケージに動物を1匹ずつ収容した．オリエンタル酵母工業製造の放射線滅菌改良NIH公開ラット・マウス飼料および水道水を自由に摂取させた．飼育ケージは隔週1回，給餌器は週1回取り換えた．

4.　試験群の構成

試験群は0，10，40，160および640 mg/kgの5群とし，1群雌雄各5匹を用い，0および640 mg/kg群に雌雄各5匹の回復群を設け，計70匹を使用した．

〔用量設定理由〕

投与量設定のための2週間反復投与試験を0，10，40，160および640 mg/kgの5用量で実施した結果，160 mg/kg以上の群で雌雄とも自発運動低下が観察されたが，他の検査項目では明らかな影響は認められなかった．したがって，28日間反復投与毒性試験の最高用量は本試験の640 mg/kgが適当と考えられ，以下公比4で除し，高用量を160 mg/kg，中用量を40 mg/kgと設定し，さらに低用量を10 mg/kgと設定した．

5.　投与方法

被験物質はコーン油に溶解し，胃ゾンデを用いて胃内に強制経口投与した．投与容量は体重100 g当たり0.5 mLとした．対照群には媒体のみ投与した．なお，投与期間は28日間とし，0および640 mg/kg群についてはさらに投与期間終了後に2週間の回復期間を設けた．

6.　投与液の調製

被験物質は，各用量(10，40，160および640 mg/kg)ごとに所定量を精秤し，コーン油(ナカライテスク)に溶解した．投与液の調製は毎日1回，投与前3時間以内に実施したが，投与液中の被験物質の安定性が確認されたため，投与11日以降調製を週1回に変更した．調製頻度の変更後，調製液は1日分毎に小分けをし，使用時まで冷蔵庫に保管した．

7.　観察，測定および検査

1)　一般状態の観察

全動物を毎日3回観察し(投与前，投与後1および5時間)，中毒症状の有無，行動異常，死期の迫った動物および死亡動物の有無等を記録した．

2)　体重

投与開始から回復期間終了時まで，毎週1回測定した．

3)　摂餌量

毎週1回給餌した残量を測定し，飼料摂取量(g/week)を算出した．

4)　血液学検査

投与期間終了時および回復期間終了時の計2回実施した．動物を約16時間絶食させた後，動物をエーテルで麻酔後開腹し，腹部大動脈から採血した．採取した血液の一部にEDTA-2Kを添加し，白血球数(WBC:フローサイトメトリー法)，赤血球数(RBC:暗視野板法)，ヘモグロビン量(HGB:シアンメトヘモグロビン法)，ヘマトクリット値(HCT:RBC，MCVより算出)，平均赤血球容積(MCV:暗視野板法)，平均赤血球血色素量(MCH:HGB，RBCより算出)，平均赤血球血色素濃度(MCHC:HGB，HCTより算出)，血小板数(PLT:暗視野板法)および白血球百分率(フローサイメトリー法)を血液自動分析装置THMS H・1E(米国マイルス社)を用いて測定した．さらに，3.13 %クエン酸ナトリウム水溶液添加血液の血漿を用いて，プロトロンビン時間(Quick1段法)，活性化部分トロンボプラスチン時間(クロット法)およびフィブリノーゲン量(トロンビン時間法)を血液凝固自動測定装置KC-40(独国Amelung社)を用いて測定した．

5)　血液生化学検査

血液学検査に引き続き採取した血液を静置後，遠心分離して得られた血清を用いて，総蛋白(Biuret法)，アルブミン(BCG法)，A/G比(計算値)，血糖(グルコースオキシダーゼ法)，中性脂肪(酵素比色法)，総コレステロール(コレステロールオキシダーゼ法)，尿素窒素(BUN:ウレアーゼアンモニア指示薬法)，総ビリルビン(ジアゾ法)，カルシウム(アルセナゾ法)，無機リン(モリブデン酸青法)，ナトリウム(電極法)，カリウム(電極法)および塩素(電極法)をEKTACHEM 700N(米国コダック社)で，クレアチニン(Jaff法)，グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ(GOT:IFCC法)，グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(GPT:IFCC法)，γ -グルタミルトランスペプチダーゼ(γ-GTP:Orlowski法)およびアルカリホスファターゼ(ALP:Bessey-Lowry改良法)をCentrifiChem ENCORE(米国ベーカー社)で測定した．

6)　尿検査

投与期間終了週および回復期間終了週の計2回実施した．採尿器を用いて24時間(午前10時から翌日午前10時まで)尿を採取し，尿量，色調および濁度を検査後，尿比重計UR-S(アタゴ)を用いて尿比重を測定した．また，尿を遠心分離後Sternheimer変法により沈渣を染色し，鏡検した．pH，潜血，ケトン体，糖，蛋白，ビリルビンおよびウロビリノーゲンについて，N-マルティスティックスSG試験紙(マイルス・三共)およびCLINITEK 200(米国マイルス社)を用いて測定した．

7)　病理学検査

投与期間終了時および回復期間終了時に動物をエーテル麻酔し，放血安楽死させ病理解剖を実施した．また，脳，肝臓，腎臓，脾臓，副腎，精巣，卵巣および胸腺について重量を測定し，器官重量/体重比を算出した．上記重量測定器官と下垂体，眼球，甲状腺(上皮小体を含む)，心臓，肺，胃，膀胱，骨髄(大腿骨)および肉眼所見で変化が認められた雌のリンパ節，胸腔の塊，縦隔の塊，子宮および横隔膜について10 %中性緩衝ホルマリン液で固定した．

病理組織学検査は固定した器官・組織のうち，投与期間終了時に解剖した対照群および640 mg/kg群の胸腺，心臓，肝臓，脾臓，腎臓，副腎および骨髄(大腿骨)について検索した．なお，投与期間終了時の肉眼所見において，肺に褐色斑/区域および赤色斑/区域が雄の投与群で観察された．また，雌では対照群にも肺の褐色斑/区域が観察された．さらに，病理組織学検査の結果，雄では腎臓の好酸性小体が，対照群と比べ最高用量群で僅かに多く観察された．したがって，雌雄の肺，雄の腎臓についてその他の投与群および回復群の病理組織学検査を実施した．常法に従って薄切標本を作製し，ヘマトキシリン・エオジンで染色した後，鏡検した．上述の染色に加え，対照群および640 mg/kg群の腎臓について，a 2μグロブリン抗体による免疫組織化学染色を実施した．

8.　統計解析

各試験群の体重，摂餌量，血液学検査値，血液生化学検査値，尿検査値(尿量および尿比重のみ)，器官重量および器官重量/体重比は，等分散および標本数の相違により，Dunnett，Duncanまたはノンパラメトリック型Dunnettの多重比較検定１,２）で対照群と各投与群間の有意差を検定した．また，病理学検査結果についてはFisherの直接確率検定を実施した．有意水準は，5および1 %の両側検定で実施した．

結果

1.　死亡率

投与期間中および回復期間中，雌雄とも対照群を含むすべての試験群で死亡例は認められなかった．

2.　一般状態の観察

雄の640 mg/kg群では，投与初日に軽度(±)，投与3日に中等度(＋)のよろめき歩行を示す例が認められ，さらに投与2日に軽度(±)，投与3日に中等度(＋)の自発運動低下を示す例が認められた．よろめき歩行は，発現のなかった5日間を除き，投与期間中ほぼ毎日観察され，投与28日には10例全例に観察された．自発運動低下は，投与期間中ほぼ毎日観察され，全例に観察された日も多かった．また，重度(++)の歩行困難が投与25日に1例観察された．

雌の640 mg/kg群では，投与初日に軽度(±)，投与3日に中等度(＋)のよろめき歩行を示す例が認められ，さらに，投与2日に軽度(±)，投与3日に中等度(＋)の自発運動低下を示す例が認められた．よろめき歩行は，投与期間中ほぼ毎日観察され，投与21および28日には10例全例に観察された．自発運動低下は，投与期間中ほぼ毎日観察され，全例に観察された日も多かった．

なお，回復期間には，雌雄いずれの群にも症状は認められなかった．

3.　体重(Figure 1)

雄では対照群に比較して，640 mg/kg群で投与4週に低値傾向が認められ，投与4週間の体重増加量にも低値傾向が認められた．また，同群では回復1および2週に体重の低値が認められた．

雌では対照群に比較して，640 mg/kg群で投与4週間の体重増加量に低値傾向が認められたが，回復2週間の体重増加量には高値が認められた．

4.　摂餌量

雌雄とも投与期間を通じて，対照群と被験物質投与群とで差が認められなかった．対照群に比較して，640 mg/kg群では，雌で回復1および2週に高値が認められ，2週間の総摂餌量にも高値が認められたが，雄では群間に差は認められなかった．

5.　血液学検査(Table 1)

〔投与期間終了時の検査結果〕

雌雄ともに対照群と被験物質投与群とでいずれの検査項目にも差は認められなかった．

〔回復期間終了時の検査結果〕

対照群に比較して，雄の640 mg/kg群でMCVの低値および白血球数の高値が認められた．

雌では，対照群と640 mg/kg群とでいずれの検査項目にも差が認められなかった．

6.　血液凝固能検査(Table 1)

〔投与期間終了時の検査結果〕

640 mg/kg群では，雌雄とも対照群に比較してフィブリノーゲンが高値を示した．

〔回復期間終了時の検査結果〕

雌雄とも，対照群と640 mg/kg群とでいずれの検査項目にも差が認められなかった．

7.　血液生化学検査(Table 2)

〔投与期間終了時の検査結果〕

雌雄とも，対照群と被験物質投与群とでいずれの検査項目にも差が認められなかった．

〔回復期間終了時の検査結果〕

雌雄とも，対照群と640 mg/kg群とでいずれの検査項目にも差が認められなかった．

8.　尿検査(Table 3)

〔投与期間終了時の検査結果〕

雌雄とも，対照群と被験物質投与群とでいずれの検査項目にも差が認められなかった．

〔回復期間終了時の検査結果〕

雌雄とも，対照群と640 mg/kg群とでいずれの検査項目にも差が認められなかった．

9.　器官重量(Table 4)

〔投与期間終了時の検査結果〕

雄では，対照群と被験物質投与群とでいずれの器官重量にも差が認められなかった．

雌では対照群に比較して，640 mg/kg群で胸腺重量の低値が認められた．

〔回復期間終了時の検査結果〕

雌雄とも，対照群と640 mg/kg群とでいずれの器官重量にも差が認められなかった．

10.　器官重量/体重比(相対重量)(Table 4)

〔投与期間終了時の検査結果〕

雄では対照群に比較して，10および160 mg/kg群で副腎相対重量の高値が認められたが，用量に対応した変化ではなかった．

雌では対照群に比較して，640 mg/kg群で肝臓相対重量の高値が認められた．

〔回復期間終了時の検査結果〕

雄では対照群に比較して，640 mg/kg群で脳相対重量の高値が認められた．

雌では対照群に比較して，640 mg/kg群で肝臓相対重量の高値が認められた．

11.　病理学検査

a)　剖検所見(Table 5)

〔投与期間終了時計画解剖動物〕

対照群に比較して被験物質投与群で多くみられた所見はなかった．ただし，雄の対照群，10，40，160および640 mg/kg群で，肺の褐色斑/区域が，それぞれ5例中0，2，1，2および2例に，肺の赤色斑/区域が，それぞれ0，0，1，1および1例に観察された．その他の病変はいずれも少数例あるいは単発性に観察された．

〔回復期間終了時計画解剖動物〕

対照群に比較して被験物質投与群で多くみられた所見は観察されなかった．

b)　組織所見(Table 6)

〔投与期間終了時計画解剖動物〕

腎臓の好酸性小体が雄の対照群で5例中2例に対し640 mg/kg群で5例全例とわずかに発生数の増加がみられた．その他，対照群に比較して被験物質投与群で多くみられた所見はなかったが，肺の出血，細胞浸潤，動脈中膜肥厚，腎臓の尿細管好塩基化，リンパ球浸潤，肝臓の巣状壊死，リンパ球浸潤および小肉芽腫などが対照群および投与群に観察された．

〔回復期間終了時計画解剖動物〕

対照群に比較して被験物質投与群で多くみられた所見はなかったが，肺の出血および細胞浸潤，腎臓の好塩基化，好酸性小体およびリンパ球浸潤などの投与期間終了時計画解剖動物に観察された所見とほぼ同様の所見が，対照群および投与群に観察された．なお，対照群および640 mg/kg群の代表例の腎臓について，a 2μグロブリン抗体による免疫組織化学染色を実施した．その結果，腎臓尿細管内に観察された好酸性小体(エオジン好性小滴)が陽性反応を示した．

考察

一般状態の観察では，雌雄とも640 mg/kg群で自発運動低下およびよろめき歩行が，さらに雄で歩行困難が認められ，被験物質投与の影響と考えられた．

体重は，雄の640 mg/kg群で投与期間後半に低値傾向が認められ，回復期間においてもその差は縮まらず，回復は認められなかったものと判断された．また，雌の640 mg/kg群においても投与期間に低値傾向が認められたが，回復期間には回復が認められた．

摂餌量測定の結果，雌雄とも投与期間においては，被験物質投与による影響は認められなかった．なお，回復期間の雌の640 mg/kg群の高値は，体重高値に対応したものであった．

血液学検査の結果，投与期間終了時の検査では雌雄とも被験物質投与による影響は認められなかった．回復期間終了時に雄の640 mg/kg群でMCVが低値を示し，白血球数が高値を示したが，いずれも投与期間終了時には認められなかった変化であること，変化の程度も僅かであることから，被験物質投与による影響ではないと判断された．

血液凝固能検査の結果，雌雄の640 mg/kg群でフィブリノーゲンが高値を示したが，炎症性疾患やネフローゼなど高値を誘起する病変が認められないことから，本試験でのフィブリノーゲン高値の原因は明らかではない．

血液生化学および尿検査では，雌雄とも投与期間および回復期間を通じて群間で差は認められず，被験物質投与の影響はなかった．

器官重量測定では，雌の640 mg/kg群で被験物質投与に起因する変化と考えられる胸腺実重量の低値が認められたが，回復期間終了時には上述の変化は回復した．また，同群で肝臓相対重量の高値が認められたが，同器官の血液生化学および病理学検査では重量増加の要因となる変化または対応所見は認められなかった．しかしながら，肝臓相対重量の高値は回復期間終了時においても認められており，毒性学的意義は不明であるが被験物質投与による影響が示唆された．その他，回復期間終了時に雄の640 mg/kg群で脳相対重量の高値が認められたが，投与期間終了時には同群で認められなかった変化であり，被験物質投与による影響ではないと判断された．

病理学検査の結果，対照群と比較して投与群に明らかに多くみられた所見はなかった．なお，雄では腎臓の好酸性小体が対照群に比べて最高用量群でわずかに多く観察された．この腎臓の好酸性小体［外国では hyaline body の一種とされている３）］は，a 2μグロブリンの存在が証明されている４）．雄のラットにD-リモネンや無鉛ガソリンなどの化学物質を投与すると近位尿細管内に好酸性小体が激増するといわれている５）．本試験でも用量に対応して増加するようにもみられるが，統計学的に有意な増加や程度の増強は観察されていない．また，a 2μグロブリン抗体による免疫染色でも，被験物質投与群にみられた好酸性小体(エオジン好性小滴)は対照群と同様に陽性反応を示すことから被験物質投与の影響とは考えられなかった．

一方，投与期間終了時の肉眼所見において特に雄の投与群で多く発生した肺の褐色斑/区域は，直径1〜2 mm程度の褐色あるいは黒色調の小さな斑点が単一あるいは少数個観察されたものであり，組織学的には限局性の出血，その周囲間質への炎症細胞浸潤などで説明される変化と考えられた．これらの組織変化は，雌雄とも発生率および程度に群間の明確な差はみられなかったことから，被験物質投与による変化ではなく，自然発生的な変化と考えた．

その他に観察された所見も発生率および程度に用量相関性は認められずすべて自然発生性病変と考えられた．

以上の結果から，雌雄とも640 mg/kg群で被験物質投与の影響が明確に認められたことから，トリメチルシラノールの無影響量(NOEL)は160 mg/kg/dayと判断された．

文献

1)佐野正樹, 岡山佳弘, 医薬安全性研究会会報, 32, 21, (1990).
2)M.Yoshida, J.J. Soc. comp. Stat., 1, 111,(1988).
3)渡辺満利, "泌尿器系, 毒性病理学," 前川昭彦, 林裕造編, 地人書館, 1991, p. 229.
4)伊東信行, "腎臓, 最新毒性病理学," 中山書店, 1994, p. 200.
5)C.L. Alden and C.H. Frith, "Urinary System, Handbook of toxicologic pathology," ed. by W.M. Haschek and C.G. Rousseaux, Academic Press, Inc., San Diego, 1991, pp. 340-342.

連絡先
試験責任者：大庭耕輔
試験担当者：各務　進, 庄子明徳, 渡　修明, 小林和雄, 岩田　聖
(財)食品農医薬品安全性評価センター
〒437-1213　静岡県磐田郡福田町塩新田字荒浜582-2
Tel 0538-58-1266Fax 0538-58-1393

Correspondence
Authors:Kousuke Oba(Study director),
Susumu Kakamu, Akinori Shoji,
Nobuaki Watari, Kazuo Kobayashi,
Hijiri Iwata
Biosafety Research Center, Foods, Drugs and Pesticides(An-pyo Center)
582-2 Arahama, Shioshinden, Fukude-cho, Iwata-gun, Shizuoka, 437-1213, Japan
Tel +81-538-58-1266Fax +81-538-58-1393