4-クロロフェノールのラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験
Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of 4-Chlorophenol in Rats
要約
OECD既存化学物質安全性点検に係わる毒性調査の一環として，4-クロロフェノールを0(対照)，20，100および500 mg/kgの用量で1群雌雄各6匹のCrj:CD(SD)IGSラットに28日間反復経口投与する毒性試験を実施した．対照群および500 mg/kg群にはそれぞれ雌雄各6匹の14日間回復群を設けた．
死亡はいずれの群にもみられなかった．一般状態では，500 mg/kg群の雌雄で振戦，頻呼吸，および流涎が認められた．本症状は投与後約5分から発現し，発現後20ないし30分以内に消失する変化であった．
尿検査では，100 mg/kg群の雄および500 mg/kg群の雌雄で尿量の増加または増加傾向が認められ，さらに100 mg/kg群の雄で尿浸透圧および比重の低下，500 mg/kg群の雄で尿浸透圧の低下傾向が認められた．また，500 mg/kg群の雄1例で重度の尿潜血陽性および尿沈渣における軽度の赤血球陽性が認められた．
血液学検査では，500 mg/kg群の雄で白血球数の増加が認められた．
体重，摂餌量，血液生化学検査，剖検，器官重量および病理組織学検査では，被験物質投与の影響は認められなかった．
回復群では，投与期間中にみられた変化に回復性が認められた．
以上の結果から，本試験条件下における無影響量は雄で20 mg/kg/day，雌で100 mg/kg/dayと考えられた．
方法
1. 被験物質および投与液の調製
4-クロロフェノール(純度99.29 %，Lot No. PJF-3，イヌイ(株)提供，大阪)は白色〜淡褐色の結晶である．入手後の被験物質は室温，遮光下で保存し，投与期間終了後に提供元にて分析を行い，試験期間中安定であったことを確認した．媒体にはコーンオイル(Lot No. V9F1519，ナカライテスク(株))を使用し，これに被験物質を0.4，2.0および10.0 w/v%の濃度になるように溶解して投与液を調製した．調製は週1回以上の頻度で行い，調製した投与液は褐色ガラスバイアルに入れて室温保存した．なお，初回調製時に投与液の濃度を測定し，設定値の± 5 %以内にあることを確認した．また，投与開始前に本調製法による0.2および40 w/v%のコ−ンオイル溶液は，室温散光下で8日間安定であることを確認した．
2. 使用動物および飼育条件
5週齢のCrj:CD(SD)IGSラット(日本チャールス・リバー(株))を雌雄各45匹購入し，雄は6日間，雌は7日間の検疫馴化を行ったのち，雌雄各36匹を次項に記載の方法で選んで6週齢で試験に使用した．投与開始時の体重は，雄が187.0〜214.0 g，雌が145.3〜171.5 gであった．動物は，温度24 ± 2 ℃，湿度55 ± 10 %，照明12時間(午前7時〜午後7時)および換気回数13〜15回/時に設定したバリアーシステム飼育室でステンレススチール製ハンガーケージに個別に収容して飼育した．飼料は高圧蒸気滅菌処理した固型飼料(MF，オリエンタル酵母工業(株))を，飲水は次亜塩素酸ナトリウムを添加(約2 ppm)した井戸水をそれぞれ自由に摂取させた．
3. 投与量，投与方法，試験群構成および群分け
投与量は，予備試験の結果より設定した．すなわち，本被験物質の20，100および500 mg/kgを2週間反復経口投与した結果，500 mg/kg群の雌雄で頻呼吸，振戦，自発運動の低下および流涎が認められた．したがって，本試験では500 mg/kgを高用量に設定し，以下公比5をもって，100および20 mg/kgをそれぞれ中用量および低用量に設定した．試験群は，上記3用量に媒体のみを投与する対照を加え計4群とした．1群当たりの動物数は，投与期間終了時の剖検例として各群とも雌雄各6匹，さらに，対照群および500 mg/kg群には14日間の回復期間終了時の剖検例として各群とも雌雄各6匹を設けた．群分け投与開始前日の体重を基に層別連続無作為化法で行った．
投与経路は経口とし，胃管を用いた強制投与を1日1回，28日間反復して行った．投与容量は5 mL/kgとし，個体ごとの投与液量は最新の体重を基に算出した．回復試験に供した動物は，投与期間終了後に14日間無処置で飼育した．
4. 検査項目
1) 一般状態の観察，体重および摂餌量の測定
投与期間中は毎日投与前，投与後約5〜30分および投与後約1時間の計3回，回復期間中は毎日午前および午後の計2回，一般状態および死亡の有無を観察した．また，体重および摂餌量を投与期間および回復期間を通して週2回の頻度で測定した．
2) 尿検査
投与第4週(検査当日の投与前)および回復第2週に，代謝ケージにて絶食，給水下で午前中の時間帯に採取した新鮮尿を用いて，比色試験紙(プレテスト8a，和光純薬工業(株))によりpH，蛋白質，ブドウ糖，ケトン体，ビリルビン，潜血およびウロビリノーゲンを検査した．さらに，新鮮尿は1500回転/分で5分間遠心分離し，得られた尿沈渣について鏡検した．また，新鮮尿採取後に給餌，給水下で採取した24時間蓄積尿を用いて，尿量(メスシリンダ−測定)，色調(肉眼的観察)，浸透圧(氷点降下法;OSMOMETER OM801，VOGEL社)および比重(屈折率法;尿屈折計，(株)アタゴ)を測定した．
3) 血液学検査
投与期間および回復期間終了後に，動物を18時間以上絶食させたのち，ペントバルビタール・ナトリウム(30 mg/kg)の腹腔内投与による麻酔下に開腹し，後大静脈から採血を行った．採取した血液の一部はEDTA-2K処理(EDTA-2K加血液)して多項目自動血球計数装置(Sysmex CC-780，シスメックス(株))を用いて，白血球数(電気抵抗検出方式)，赤血球数(電気抵抗検出方式)，ヘモグロビン量(Oxyhemoglobin法)，ヘマトクリット値(血球pulse波高値検出方式)および血小板数(電気抵抗検出方式)を測定し，赤血球数，ヘモグロビン量およびヘマトクリット値の測定結果を基に平均赤血球容積(MCV)，平均赤血球血色素量(MCH)および平均赤血球血色素濃度(MCHC)を算出した．また，血液の一部は塗抹標本とし，May-Gr
nwald-Giemsa染色を施して白血球百分比を算出し，網状赤血球率検査用のNew methylene blue超生体染色標本を作製して保存した．さらに，3.8 %クエン酸ナトリウム加血液を3000回転/分で15分間遠心分離し，得られた血漿を用いて全自動血液凝固測定装置(Sysmex CA-5000，シスメックス(株))により，プロトロンビン時間(散乱光検出方式)および活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT，散乱光検出方式)を測定した．
4) 血液生化学検査
血液学検査に引き続き採取した血液を室温で約60分間放置後，3000 回転/分で10分間遠心分離し，得られた血清を用いて自動分析装置(7170，(株)日立製作所)により，総蛋白質(T. protein, Biuret法)，アルブミン(BCG法)，A/G比(総蛋白質及びアルブミンより算出)，総ビリルビン(T.bilirubin, Vanadate oxidation法)，GOT(UV-rate法)，GPT(UV-rate法)，γ-グルタミルトランスペプチダーゼ(γ-GTP，L-γ-Glutamyl-3-hydoroxymethyl-4-nitroanilide基質法)，アルカリ性フォスファターゼ(ALP, ρ-Nitrophenylphosphate acid基質法)，コリンエステラーゼ(Butyrylthiocholine-DTNB法)，アセチルコリンエステラーゼ(Acetylcholine基質法)，総コレステロール(T. cholesterol, COD-HDAOS法)，トリグリセライド(GPO-HDAOS法, glycerol blanking法)，リン脂質(Choline oxidase-DAOS法)，グルコース(Hexokinase-G-6-PDH法)，尿素窒素(BUN, Urease-GLDH法)，クレアチニン(Jaff
法)，無機リン(IP, PNP-XOD法)およびカルシウム(Ca, MXB法)を測定した．また，電解質分析装置(PVA-γIII，(株)アナリティカル・インスツルメンツ)によりナトリウム(Na，電極法)，カリウム(K，電極法)およびクロール(Cl，電量滴定法)を測定した．
5) 器官重量の測定，剖検および病理組織学検査
採血後に放血致死させ，剖検した．剖検後に脳，下垂体，甲状腺(上皮小体を含む)，心臓，肺(気管支を含む)，胸腺，肝臓，脾臓，腎臓，副腎，精嚢，精巣上体，精巣および卵巣を摘出して器官重量(絶対重量)を測定するとともに，剖検日の体重を基に体重比器官重量(相対重量)を算出した．これらの器官に加え，脊髄(頸部から胸部)，眼球，気管，膵臓，胃，十二指腸，空腸，回腸(パイエル板を含む)，盲腸，結腸，直腸，腸間膜リンパ節，膀胱，子宮，骨髄(大腿骨)，坐骨神経および肉眼的異常部位を採取して10 %中性緩衝ホルマリン溶液(眼球は2.5 %グルタールアルデヒド溶液，精巣および精巣上体はブアン液で前固定)に固定した．投与期間終了時の対照群および500 mg/kg群の眼球を除く上述した器官および肉眼的異常部位については，常法に従ってパラフィン切片を作製し，ヘマトキシリン・エオジン染色を施して光学顕微鏡下で観察した．なお，投与期間終了時の検査において，被験物質投与に関連する変化がみられなかったことから，回復期間終了時の検査は実施しなかった．
5. 統計解析
体重，摂餌量，尿検査(定性反応は除く)，血液学検査，血液生化学検査，器官重量および体重比器官重量について，各群ごとに平均値と標準偏差を求め，Bartlett法により分散の均一性を検定した．分散が均一な場合はDunnettの多重比較検定を用いて，分散が均一でない場合はSteelの多重比較検定を用いて対照群との比較を行った．また，病理組織学検査においてみられた所見については，Mann-WhitneyのU検定を実施した．いずれの場合も有意水準を1および5 %とした．
結果
1. 一般状態
すべての群に死亡例はなく，20および100 mg/kg群では観察期間を通して被験物質投与に関連した一般状態の変化は認められなかった．
500 mg/kg群では，投与期間を通して振戦，頻呼吸および流涎が認められた．振戦は雄で2〜6例/日，雌で1〜6例/日の頻度で認められ，総発現例数は雄で全例，雌で11例であった．頻呼吸は雄で0〜3例/日，雌で0〜2例/日の頻度で認められ，総発現例数は雄で11例，雌で9例であった．流涎は雄で0〜6例/日，雌で0〜4例/日の頻度で認められ，総発現例数は雄で9例，雌で8例であった．振戦，頻呼吸及び流涎の発現時間は，投与後約5分から認められ，いずれも投与後20ないし30分以内には消失した．更に，500 mg/kg群の雄1例で投与開始日に振戦および頻呼吸に加え，横臥姿勢が認められ，横臥姿勢の回復後に自発運動の低下および緩徐呼吸がみられ，投与後30分にいずれの症状も回復した．また，500 mg/kg群の雌1例で投与3日の投与前から自発運動の低下，腹式呼吸および喘鳴が認められたが，投与4日の投与前には消失し，以降投与期間を通してこれらの症状は認められなかった．回復期間において，500 mg/kg群の雌雄で変化は認められなかった．
その他，偶発的な変化として，20 mg/kg群の雄1例で頸部に外傷(掻創)が認められた．
2. 体重(Fig. 1)
投与期間及び回復期間を通して，4-クロロフェノ−ル各群は対照群とほぼ同様な推移を示した．
3. 摂餌量
投与期間を通して，4-クロロフェノ−ル各群は対照群とほぼ同様な推移を示した．回復期間では，500 mg/kg群の雄で回復11日および14日に増加が認められ，500 mg/kg群の雌で回復14日に減少が認められたが，いずれも投与期間中には認められていない変化であることから，4-クロロフェノ−ル投与との関連性はないと判断した．
4. 尿検査(Table 1)
投与4週の検査では，100および500 mg/kg群の雄で尿量の増加が認められ，500 mg/kg群の雌で尿量の増加傾向が認められた．さらに，100 mg/kg群の雄で尿浸透圧および比重の低下が認められ，500 mg/kg群の雄で尿浸透圧の低下傾向が認められた．また，500 mg/kg群の雄1例で重度の尿潜血陽性および尿沈渣における軽度の赤血球が認められた．
回復2週の検査では，500 mg/kg群の雌雄で変化は認められなかった．
5. 血液学検査(Table 2)
投与期間終了時の検査では，500 mg/kg群の雄で白血球数の増加が認められた．
回復期間終了時の検査では，500 mg/kg群の雌でMCHCの増加が認められたが，同様の変化は投与期間終了時の検査時には認められていないことから，4-クロロフェノ−ル投与との関連性はないと考えられた．
6. 血液生化学検査(Table 3)
投与期間終了時の検査では，500 mg/kg群の雄でGPTおよびカリウムの増加が認められたが，生理的な変動範囲内の変化であった．
回復期間終了時の検査では，500 mg/kg群の雄でBUNの増加が認められ，雌でGOTの減少，総コレステロールおよびリン脂質の増加が認められたが，同様の変化は投与期間終了時の検査時には認められていないことから，4-クロロフェノ−ル投与との関連性はないと考えられた．
7. 器官重量(Table 4)
投与期間終了時の検査では，4-クロロフェノール各群で被験物質投与に関連すると考えられる変化は認められなかった．なお，20 mg/kg群の雄で肝臓の相対重量の減少が認められたが，同様の変化は中用量および高用量群では認められていないことから，毒性学的意義はないと考えられた．
回復期間終了時の検査では，500 mg/kg群の雄で肝臓の絶対および相対重量の増加，精嚢の相対重量の減少が認められ，雌で下垂体および副腎の絶対重量の減少が認められたが，同様の変化は投与期間終了時の検査時には認められていないことから，4-クロロフェノ−ル投与との関連性はないと考えられた．
8. 剖検
投与期間終了時の検査では，4-クロロフェノール各群で被験物質投与に関連すると考えられる変化は認められなかった．偶発的な変化として，一般状態で外傷(掻創)がみられた20 mg/kg群の雄1例に頸部皮膚の痂皮形成が認められた．
回復期間終了時の検査では，対照群および500 mg/kg群ともに変化は認められなかった．
9. 病理組織学検査(Table 5)
投与期間終了時の検査では，4-クロロフェノール各群で被験物質投与に関連すると考えられる変化は認められなかった．偶発的な変化として，20 mg/kg群の雄1例で肉眼的に頸部皮膚の痂皮がみられた部位に，扁平上皮細胞の過形成および真皮から皮下組織にかけてリンパ球を主体とする細胞浸潤が認められ，対照群の雌1例に肝臓の門脈周囲性の脂肪変性が認められた．
考察
試験期間を通して死亡は認められなかった．一般状態観察では，500 mg/kg群の雌雄で投与後約5分から振戦，頻呼吸および流涎が認められたが，いずれも投与後20ないし30分に消失する変化であった．振戦及び頻呼吸については，4-クロロフェノールのラットにおける単回投与毒性試験においても認められており，本被験物質投与による急性中毒による変化と考えられた．流涎については，4-クロロフェノールが皮膚及び眼粘膜に対して刺激性を有することが報告されていることから，被験物質の粘膜刺激性に関連した変化であると考えられた．また，500 mg/kg群で振戦および頻呼吸に加え，横臥姿勢，自発運動の低下，緩徐呼吸，腹式呼吸あるいは喘鳴が認められ，被験物質投与の影響により，症状が強く発現する例もみられた．
体重および摂餌量では，被験物質投与に関連すると考えられる変化は認められなかった．
尿検査では，100 mg/kg群の雄および500 mg/kg群の雌雄で尿量の増加または増加傾向が認められた．また，尿量の増加に伴った変化として，100 mg/kg群の雄で尿浸透圧および比重の低下，500 mg/kg群の雄で尿浸透圧の低下傾向が認められた．また，1例のみであるが500 mg/kg群の雄で重度の尿潜血陽性および尿沈渣における軽度の赤血球陽性が認められた．これらの尿の変化について，その発生機序は不明であるが，腎機能に関連する血清パラメーターに機能障害を示唆する明らかな変化は認められておらず，腎臓の病理組織学検査においても器質的な変化は認められていないことから，毒性学的には重篤な変化ではないと考えられた．
血液学検査では，500 mg/kg群の雄で白血球数の増加が認められたが，白血球画分の比率に変化は認められておらず，病理組織学検査においても白血球数の増加を示唆する変化は認められていないことから，毒性学的には重篤な変化ではないと考えられた．
血液生化学検査では，500 mg/kg群の雄でGOTおよびカリウムの増加が認められた．GOTは，肝臓，心筋などの細胞内に多く局在する酵素であるが，病理組織学検査では肝臓，心臓などに器質的な変化はなく，かつ生理的な変動範囲内の軽度な変化であることから，被験物質投与との関連性はないと考えられた．カリウムの増加については，一般に高カリウム血症は腎機能障害や高度の脱水によって生ずることが知られているが，上述のように腎機能及び器質的障害や高度な脱水は認められておらず，かつ生理的な変動範囲内の軽度な変化であることから，被験物質投与との関連性はないと考えられた．
器官重量，剖検および病理組織学検査では，被験物質投与に関連すると考えられる変化は認められなかった．
回復試験では，上述の投与期間中にみられた変化には回復性が認められたことから，被験物質投与で生じた変化は可逆的であると考えられた．
以上のように，本試験では100 mg/kg群の雄で尿量の増加が認められ，500 mg/kg群の雌雄で振戦，頻呼吸，流涎および尿量の増加または増加傾向，雄で白血球数の増加が認められたことから，無影響量は雄で20 mg/kg/day，雌で100 mg/kg/dayと考えられた．
| 連絡先 |
| 試験責任者： | 古川浩美 |
| 試験担当者： | 一村憲児，浜村政夫，和泉宏幸，神谷光一，鍬先恵美子 |
| (株)パナファ−ム・ラボラトリ−ズ安全性研究所 |
| 〒869-0425 熊本県宇土市栗崎町1285 |
| Tel 0964-23-5111 | Fax 0964-23-2282 | |
| Correspondence |
| Authors: | Hiromi Furukawa(Study Director)
Kenji Ichimura, Masao Hamamura, Hiroyuki Izumi, Kouichi Kamiya, Emiko Kuwasaki |
| Safety Assessment Laboratory, Panapharm Laboratories Co., Ltd. |
| 1285 Kurisaki-machi, Uto-shi, Kumamoto, 869-0425, Japan |
| Tel +81-964-23-5111 | Fax +81-964-23-2282 | |