1,4-ジブロモベンゼンのラットを用いる経口投与による28日間反復投与毒性試験
Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of
1,4-Dibromobenzene in Rats
要約
医薬品・農薬などの合成中間体や燻蒸剤として用いられている既存化学物質1,4-ジブロモベンゼンの28日間反復投与毒性試験を，SD系［Crj:CD(SD)］ラットを用い，0（対照），4，20，100および500mg/kg/day用量の経口投与により実施した．動物数は1群雌雄各6匹とし，7群を設け，5群は投与終了後屠殺群，2群は対照および500mg/kgの14日間回復群とした．
500mg/kg群で雄の1匹が死亡した．摂餌量の減少が500mg/kg群の雌雄で投与初期に認められたが，体重に対する有意な影響や一般状態の変化は認められなかった．病理学的検査においては，肝臓に肝細胞の腫大が100mg/kg以上の群の雌雄に認められた．腎臓には尿細管に好酸体や硝子滴の出現および尿細管の再生像が20mg/kg以上の群の雄に，糸球体毛細血管の拡張が100mg/kg以上の群の雌に認められた．100あるいは500mg/kg群では，肝臓および腎臓の重量増加やこれら器官の機能異常を示唆する血液生化学的所見が認められた．また，副腎の皮質細胞には空胞の増加が100mg/kg以上の群，小腸には粘膜上皮の空胞化が500mg/kg群のいずれも雌雄に認められた．さらに，血液プロトロンビン時間の短縮が20mg/kg以上の群の雌に，活性化部分トロンボプラスチン時間の延長が500mg/kg群の雌雄に認められた．回復群においては，これらの変化は回復傾向を示した．
以上の結果から，1,4-ジブロモベンゼンは，ラットの肝臓，腎臓，小腸，副腎および血液凝固系に対し毒性影響を有し，その無影響量は4mg/kg/dayと推定された．
方法
１．被験物質
被験物質1,4-ジブロモベンゼンは白色の結晶物で，水にほとんど溶けず，ベンゼン，クロロホルムにやや溶けやすく，エーテルにきわめて溶けやすい．試験には，東ソー株式会社（東京）から提供されたもの（ロット番号22061，純度99.9％）を用い，これを局方ゴマ油（宮澤薬品）に溶解して投与液とした．被験物質原体および投与液中の被験物質は，安定であることを確認した．
２．使用動物および飼育条件
日本チャールス・リバー株式会社より購入した5週齢のSD系［Crj:CD(SD)］ラット（雄146〜182g，雌137〜159g）を1群雌雄各6匹として用いた．ラットは，温度22±3℃，湿度55±10％，換気回数10回以上/時，照明12時間（6時〜18時）に設定した飼育室で金網ケージに個別に収容して飼育し，固型飼料［日本農産工業（株），ラボMRストック］と水を自由摂取させた．
3．投与量および投与方法
投与量設定試験を，5週齢のSD系［Crj:CD(SD)］ラットを1群雌雄各4匹とし，0，50，100，200，500および1000mg/kg用量の14日間経口投与により実施した．100mg/kg以上の群で肝臓重量ならびに血清総コレステロールおよび総ビリルビンの増加，200mg/kg以上の群で腎臓重量および血清総タンパクの増加ならびにグルコースの減少，500mg/kg群で活性化部分トロンボプラスチン時間，血清GPT活性およびトリグリセライドの増加ならびに塩素の減少が認められ，1000mg/kg群では雌雄全例が死亡した．したがって，本試験における投与量は，500mg/kgを最高用量とし，以下100，20および4mg/kgの4用量，ならびに対照を設定した．試験群は，以上の5群の他に500mg/kgおよび対照の14日間回復群を設けた．投与は，胃ゾンデを装着した注射筒を用いて，投与液を1日1回，28日間にわたって経口投与した．投与液量は，体重100g当たり0.5mlとした．対照群には，溶媒であるゴマ油を同様に投与した．
4．観察および検査項目
1）一般状態観察
投与および回復期間中毎日，生死および外観，行動等を観察した．
2）体重および摂餌量測定
体重は，投与期間中においては毎日投与直前に，回復期間中は週1回測定した．摂餌量は，ケージごとに週1回，24時間の消費量を測定し，1匹当たりの平均摂餌量を算出した．
3）尿検査
投与26日および投与終了後12日に腰背部を刺激して強制排尿させ，pH，潜血，タンパク，糖，ケトン体，ビリルビンおよびウロビリノーゲン［以上，マイルス・三共（株），マルティスティックス］ならびに外観を検査した．
4）血液学的検査
供試血液の採取は，投与期間および回復期間終了翌日における屠殺剖検時に行った．動物は採血前日の午後5時より除餌し，水のみを給与した．採取した血液は3分割し，その一部はEDTA-2Kで凝固防止処理し，多項目自動血球計数装置［東亜医用電子（株），E-4000］により，赤血球数（電気抵抗検出方式），血色素量（ラウリル硫酸ナトリウム-ヘモグロビン法），ヘマトクリット値（パルス検出方式），平均赤血球容積，平均赤血球血色素量，平均赤血球血色素濃度（以上，計算値），白血球数および血小板数（以上，電気抵抗検出方式）を，また塗抹標本を作製して網状赤血球数（Brilliant cresyl blue染色）および白血球百分率（May-Giemsa染色）を測定した．さらに一部は3.8％クエン酸ナトリウム液で処理して血漿を得，血液凝固自動測定装置（アメルング社，KC-10A）により，プロトロンビン時間（Quick一段法）および活性化部分トロンボプラスチン時間（エラジン酸活性化法）を測定した．
5）血液生化学的検査
採取した血液の一部から血清を分離し，生化学自動分析装置[日本電子（株），JCA-VX-1000型クリナライザー]により，総タンパク（Biuret法），アルブミン（BCG法），A/G比（計算値），グルコース，トリグリセライド，総コレステロール（以上，酵素法），総ビリルビン(Jendrassik法），尿素窒素（Urease-UV法），クレアチニン（Jaffe法），GOT，GPT，γ-GTP（以上，SSCC法），アルカリフォスファターゼ（GSCC法），カルシウム（OCPC法）および無機リン（酵素法）を，電解質自動分析装置［東亜電波工業（株），NAKL-1］により，ナトリウム，カリウムおよび塩素を測定した．
6）病理学的検査
死亡および計画屠殺動物について剖検し，脳，肝臓，腎臓，副腎および精巣/卵巣を秤量した．病理組織学的検査は，採取した臓器を10％中性リン酸緩衝ホルマリン液で固定後，脳，心臓，胃，小腸，肝臓，脾臓，腎臓および副腎について，常法に従いパラフィン切片を作製し，ヘマトキシリン・エオジン（H-E）染色を施して鏡検した．また，沈着物を同定するため，一部の腎臓についてはPAS染色，小腸についてはPAS・アルシアンブルー染色およびズダンIII染色も行った．
4．統計処理
定量的所見についてはBartlettの分散検定を行い，分散が一様な場合は一元配置の分散分析を行った．分散が一様でない場合，白血球百分率および尿所見はKruskal-Wallisの順位検定を行った．それらの結果有意差を認めた場合，Dunnett法あるいはScheffe法（群の大きさが異なる場合）により対照群に対する各群の比較検定を行った．ただし，回復群についてはt検定あるいはU検定を行った．
結果
1．一般状態および死亡
500mg/kgの回復群の雄1匹が，投与28日に死亡した．この例は，前日から体重が急減し，自発運動低下，血液様の赤色尿による下腹部被毛汚染，皮膚蒼白などの症状が認められた．死亡動物を除いては，被験物質投与との関連性が考えられる一般状態の変化は認められなかった．
2．体重および摂餌量（Fig．1）
被験物質投与各群の体重は，対照群に比べて有意な変化は認められなかった．摂餌量については，500mg/kg群で雌雄とも投与1週で減少傾向，その後回復1週まで増加傾向を示し，回復2週で対照群と差はみられなくなった．雌の投与1週の減少ならびに雄の投与4週と雌雄の回復1週の増加は，対照群に比べ有意差が認められた．
3．尿所見
被験物質投与各群とも，対照群に比べ各検査項目に有意な変化は認められなかった．
4．血液学的所見（Table 1）
プロトロンビン時間の短縮が20mg/kg以上の群の雌に，活性化部分トロンボプラスチン時間の延長が500mg/kg群の雌雄に認められ，雌の活性化部分トロンボプラスチン時間の延長を除いて，いずれも対照群に比べて有意差が認められた．回復群においては，雌に活性化部分トロンボプラスチン時間の有意な延長が認められたが，雄の活性化部分トロンボプラスチン時間の変化および雌のプロトロンビン時間の変化は回復傾向を示した．
5．血液生化学的所見（Table 2）
100mg/kg以上の群において，塩素の増加が雌雄に，総ビリルビンおよび総コレステロールの増加ならびにグルコースの減少が雄に認められた．さらに，500mg/kg群では，総コレステロールの増加およびグルコースの減少が雌にも認められたほか，GPT活性，γ-GTP活性，総タンパクおよびトリグリセライドの増加が雌雄に，尿素窒素および無機リンの増加が雄に，カルシウムの増加が雌に認められた．これらの変化は，雄のGPT活性と雌のγ-GTP活性の増加を除いて，対照群に比べて有意差が認められた．回復群においては，一部に有意差は残るものの，いずれの変化にも回復傾向が認められた．
6．剖検所見
肝臓の腫大が100mg/kg群の雄および500mg/kg群の雌雄のほぼ全例に，腎臓の腫大が100mg/kg群の雄4匹と500mg/kg群の雄全例，雌4匹に認められた．さらに，500mg/kg群においては，雌雄全例の空・回腸粘膜は白色となり，副腎は雄全例と雌3匹が退色していた．また，雄1匹と雌2匹の胃の腺胃部粘膜には出血（黒色）点が認められた．投与期間中に死亡した500mg/kgの回復群の1匹には，肝臓，腎臓，副腎および小腸に同様の変化が認められたほか，肺はうっ血水腫性で，膀胱には出血が認められた．回復群においては，500mg/kgでのみ肝臓や腎臓の腫大は認められたが変化の程度や発現率は軽減し，また，その他の器官には異常は認められなかった．
7．器官重量（Table 3）
肝臓および腎臓では100mg/kg以上の群の雄と500mg/kg群の雌で，副腎では500mg/kg群の雄で重量増加を示し，100mg/kg群の肝臓の絶対重量を除き，いずれも対照群に比べ，絶対および相対重量に有意差が認められた．これらの変化は，回復群においては，肝臓および腎臓で対照群との間に有意差は残るものの，いずれも回復傾向が認められた．なお，回復群の雄の脳重量は，対照群に比べて有意に増加した．
8．病理組織学的所見（Table 4）
肝臓：小葉中心性に肝細胞の腫大が，100mg/kg以上の群の雌雄に認められた．投与28日に死亡した500mg/kg群の雄の1匹には，小葉中心性の肝細胞壊死が認められた．
胃：500mg/kg群で認められた肉眼的な前胃部粘膜の出血点は，粘膜のびらんであることが確認された．しかし，これらの発現率は，雌雄とも低かった．
小腸：腸絨毛表面に存在する円柱上皮の空胞化が500mg/kg群の雌雄に認められた．空胞化した上皮の細胞質はH-E染色で泡沫様を呈し，PAS-アルシアンブルー染色陰性，ズダンIII染色陽性で，脂質の蓄積によるものであることが確認された．
腎臓：雄において，20mg/kg以上の群で，近位尿細管にPAS染色陰性の好酸体および好酸体より小さなPAS染色陽性の硝子滴が認められた．硝子滴の出現は用量依存的であったが，好酸体は20mg/kg群で最も発現率が高く，用量の増加とともに減少する傾向にあった．また，これらの変化が認められた20mg/kg以上の群では，障害後の再生像と考えられる尿細管の目立つ例が増加する傾向にあった．雌においては，雄で認められた変化は認められなかった．しかし，これらとは別に，糸球体毛細血管の拡張が100mg/kg以上の群で，用量依存的に増加した．500mg/kg群の雌および死亡した雄では，尿細管の拡張も認められたが，この変化は軽度なもので，発現率も低かった．
副腎：皮質の特に束状帯細胞における空胞が，100mg/kg以上の群の雌雄において，用量依存的に増加した．
心臓・脾臓：心臓には，被験物質投与の影響が考えられる異常は認められなかった．脾臓は，500mg/kg群の雄の死亡例で萎縮していたが，生存動物には異常は認められなかった．
また，この死亡例については，肉眼的に変化の認められた肺および膀胱についても検査した結果，肺にはうっ血水腫が，膀胱には粘膜に出血が認められた．
回復群においては，これらの変化は回復する傾向にあり，可逆的な変化であった．また，脳重量の増加が認められた雄の脳には，病理組織学的に異常は認められなかった．ただし，雄の腎臓には，尿細管の再生像が投与期間終了後と同様に高い発現率で認められた．
考察
1,4-ジブロモベンゼンのラットへの28日間反復経口投与において，主に肝臓，腎臓，消化管，副腎ならびに血液凝固系に対し，毒性影響が認められた．
肝臓に対する影響については，肝細胞が小葉中心性に腫大し，肝臓重量は増加した．特に死亡例においては，小葉中心の肝細胞壊死も認められた．血液生化学的検査で認められた血清GPT，γ-GTP，総ビリルビン，総コレステロール，トリグリセライドおよび総タンパクの増加ならびにグルコースの減少も，肝機能に対する影響を示唆する変化と解せられる．
腎臓に対する影響については，形態的変化に性差が認められ，雄では近位尿細管に好酸体および硝子滴が出現し，障害後の再生過程にある尿細管も増加した．一方，雌では，糸球体毛細血管の拡張が認められ，雌雄とも腎臓重量は増加した．
尿細管上皮における好酸体や硝子滴については，加齢に伴って生理的にもラットに認められ，タンパクの再吸収像と考えられている．1,4-ジブロモベンゼンの投与によって発現したこれらの変化は，タンパクの再吸収過程に対する影響を示唆しており，また，血液生化学的検査で認められた血清タンパクの増加とも関連した変化と推察される．さらに，血清尿素窒素の増加や電解質の変化についても，腎機能の障害を裏付ける所見と解せられる．
1,4-ジブロモベンゼンとは類縁化合物であるブロモベンゼンには肝毒性があり，腎臓にも障害を起こすことが知られているが1)，本試験においては，1,4-ジブロモベンゼンにも肝臓および腎臓に対し毒性影響のあることが確認された．
消化管に対する影響については，小腸粘膜の絨毛上皮が空胞化し，空回腸は肉眼的にも白色化していた．この絨毛上皮の空胞はズダンIII染色陽性で，脂質の蓄積によることが確認され，上皮の脂肪吸収機能に対する影響がうかがわれた．また，胃の腺胃部粘膜には，びらんを認める例があった．
これらの変化に加えて，副腎では，皮質細胞に脂質の増加を示唆する空胞の増加が雌雄に認められ，雄の副腎重量は増加した．さらに，雌雄で活性化部分トロンボプラスチン時間の延長が，雌でプロトロンビン時間の短縮が認められ，それぞれ血液凝固系に対して内因系反応に抑制的および外因系反応に促進的な影響がうかがわれた．
以上の変化を用量との関係でみると，4mg/kg群ではこのような変化は認められなかった．20mg/kg群では，雄で腎臓に病理学的変化が，雌で血液プロトロンビン時間の短縮が認められ，雌雄とも軽度な毒性影響が発現した．100mg/kg以上あるいは500mg/kg群では，腎臓および肝臓の病理学的変化ならびにそれらとの関連性が考えられる血液生化学的変化，副腎および小腸の病理学的変化，活性化部分トロンボプラスチン時間の延長，投与開始初期における摂餌量の減少などが雌雄に認められ，500mg/kg群の雄の1匹は死亡した．
このような1,4-ジブロモベンゼンの投与によって認められた毒性影響は，回復群においては概ね回復傾向を示し，可逆的な変化であることが確認された．
以上の結果から，1,4-ジブロモベンゼンは主に肝臓，腎臓，小腸，副腎および血液凝固系に対し，毒性影響を有することが明らかとなった．また，その無影響量は，4mg/kg/dayと推定された．
文献
| 1） | M.K.William, R.M.Robert, G.Arnold and H.Frank, Fund. Appl. Toxicol., 4,1019-1028 (1984) |
| 連絡先 |
| 試験責任者: | 伊藤義彦 |
| 試験担当者: | 山本 譲，杉本忠美，赤木 博，福田苗美，潘陳眞眞 |
| （財）畜産生物科学安全研究所 |
| 〒229 神奈川県相模原市橋本台3-7-11 |
| Tel 0427-62-2775 | Fax 0427-62-7979 | |
| Correspondence |
| Authors: | Yoshihiko Ito (Study director)
Yuzuru Yamamoto，
Tadami Sugimoto，
Hiroshi Akagi，
Naemi Fukuda，
Shinshin Hanchin |
| Research Institute for Animal Science in Biochemistry and Toxicology |
| 3-7-11 Hashimotodai，Sagamihara-shi，Kanagawa，229，Japan |
| Tel +81-427-62-2775 | Fax +81-427-62-7979 | |