アセト酢酸メチルの
チャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験

In Vitro Chromosomal Aberration Test of
Methyl acetoacetate on Cultured Chinese Hamster Cells

要約

アセト酢酸メチルの培養細胞に及ぼす細胞遺伝学的影響について，チャイニーズ・ハムスター培養細胞(CHL/IU)を用いて染色体異常試験を実施した．

連続処理(24時間)および短時間処理(6時間)のS9 mix非存在下では，1.2 mg/mL(10 mmol/L)の濃度においても50 %を越える細胞増殖抑制は認められなかった．短時間処理のS9 mix存在下における50 %細胞増殖抑制濃度は，1.2 mg/mL(10 mmol/L)であった．このことから，すべての試験において1.2 mg/mL(10 mmol/L)の濃度を最高処理濃度とし，連続処理およびS9 mix非存在下での短時間処理では，公比2で3濃度，S9 mix存在下での短時間処理では，公比2で4濃度設定した．連続処理では，24時間および48時間連処理後，短時間処理ではS9 mix存在下および非存在下で6時間処理し，新鮮培地で更に18時間培養後，標本を作製し，検鏡することにより染色体異常誘発性を検討した．染色体分析が可能な最高濃度は，すべての系列で1.2 mg/mL(10 mmol/L)の濃度であったことから，これらの濃度を高濃度群として3濃度群を観察対象とした．

CHL/IU細胞を24時間および48時間連続処理したいずれの処理群においても，染色体の構造異常や倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．短時間処理では，S9 mix 非存在下で6時間処理したいずれの処理群においても倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．一方，S9 mix存在下では，高濃度群(1.2 mg/mL)において，染色体の構造異常(gapを含む)および倍数性細胞の誘発作用が認められ，その誘発頻度は11.0 %および2.75 %であった．

アセト酢酸メチルのS9 mix存在下の高濃度(1.2 mg/mL)処理では，培養液が黄色化することから，本物質の染色体異常誘発に関しては，培養液の酸性化による可能性と，DNAに対する直接的な傷害作用による2つの可能性が考えられた．このため，染色体の構造異常および倍数性細胞の誘発が認められたS9 mix存在下の1.2 mg/mLについて，被験物質を含む培地のpHを中性域に調整して，確認試験を実施したところ，染色体異常および倍数性細胞の誘発は認められなかった．従って，アセト酢酸メチル処理によって誘発された染色体異常は，培養液の酸性化による非生理的な条件に起因して生じることが示され，陰性と判断した．

方法

1.　使用した細胞

リサーチ・リソースバンク(JCRB)から入手(1988年2月，入手時:継代4代，現在12代)したチャイニーズ・ハムスター由来のCHL/IU細胞を，解凍後継代10代以内で試験に用いた．

2.　培養液の調製

培養には，牛胎児血清(FCS:Filtron)を10 vol%添加したイーグル MEM(日水製薬)培養液を用いた．

3.　培養条件

2×10^4個のCHL/IU細胞を，培養液5 mLを入れたディッシュ(径6 cm，Corning)に播き，37℃のCO2インキュベーター(5 % CO2)内で培養した．連続処理では，細胞播種3日目に被験物質を加え，24時間および48時間処理した．また，短時間処理では，細胞播種3日目にS9 mix存在下および非存在下で6時間処理し，処理終了後新鮮な培養液でさらに18時間培養した．

4.　被験物質

アセト酢酸メチル(ロット番号:602006，日本合成化学工業)は，無色透明液体で，水，DMSO，アセトンに対して50 mg/mL以上で溶解し，分子量116.12，凝固点-80℃，沸点 171.7℃で，純度99.4 wt%(不純物はメタノールと思われる物質0.6 wt%)の物質である．被験物質原体は，安定であるが，酸・アルカリ触媒で反応する．

5.　被験物質の調製

被験物質の調製は，使用のつど行った．溶媒は注射用蒸留水(ロット番号:K6G92，大塚製薬工場)を用いた．原体を溶媒に溶解して原液を調製し，ついで原液を溶媒で順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を作製した．被験物質調製液は，すべての試験において培養液の 10 vol%になるように加えた．

6.　細胞増殖抑制試験による処理濃度の決定

染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため，被験物質の細胞増殖に及ぼす影響を調べた．被験物質のCHL/IU細胞に対する増殖抑制作用は，単層培養細胞密度計(Monocellater TM，オリンパス光学工業)を用いて各群の増殖度を計測し，被験物質処理群の溶媒対照群に対する細胞増殖の比をもって指標とした．

その結果，連続処理および短時間処理のS9 mix非存在下においては1.2 mg/mL(10 mmol/L)でも50 %を越える増殖抑制作用は認められなかったが，S9 mix存在下では，50 %細胞増殖抑制濃度は1.2 mg/mL(10 mmol/L)であった(Fig. 1)．

7.　実験群の設定

細胞増殖抑制試験の結果より，染色体異常試験で用いる被験物質の高濃度群を，連続処理，短時間処理ともに1.2 mg/mL(10 mmol/L)とし，公比2で連続処理およびS9 mix非存在下での短時間処理では3濃度(0.30，0.60，1.2 mg/mL)，S9 mix存在下では4濃度を設定した(0.15，0.30，0.60，1.2 mg/mL)．また，被験物質を含む培地の pH を調整して行った確認試験として実施したS9 mix存在下での短時間処理では，1.2 mg/mL(10 mmol/L)の濃度を設けた．陽性対照物質として用いたマイトマイシンC(MC，協和醗酵工業)およびシクロホスファミド(CPA，Sigma Chemical Co.)は，注射用蒸留水(大塚製薬工場)に溶解して調製した．それぞれ染色体異常を誘発することが知られている濃度を適用した．

染色体異常試験においては1濃度あたり4枚のディッシュを用い，そのうちの2枚は染色体標本を作製し，別の2枚については単層培養細胞密度計により細胞増殖率を測定した．また，確認試験においては2枚のディッシュを用いて試験を行った．

8.　染色体標本作製法

培養終了の2時間前に，コルセミドを最終濃度が約0.1 μg/mLになるように培養液に加えた．染色体標本の作製は常法に従って行った．スライド標本は各ディッシュにつき6枚作製した．作製した標本を3 %ギムザ溶液で染色した．

9.　染色体分析

細胞増殖率測定の結果と分裂指数により，20 %以上の相対増殖率で，かつ2ディッシュともに0.5 %以上の分裂指数を示した最も高い濃度を観察対象の最高濃度群とし，観察対象の3濃度群を決定した．その結果(Table 1，2)，連続処理，短時間処理ともに1.2 mg/mL(10 mmol/L)が染色体分析の可能な最高濃度であったことから．これらの濃度を含む3濃度群を観察対象とした．また，確認試験においては，1.2 mg/mL(10 mmol/L)を観察対象とした．

作製したスライド標本のうち，1つのディッシュから得られた異なるスライドを，4名の観察者がそれぞれ処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した．染色体の分析は，日本環境変異原学会・哺乳動物試験研究会(MMS)１）による分類法に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型のギャップ，切断，交換などの構造異常の有無と倍数性細胞(polyploid)の有無について観察した．また，構造異常については1群200個，倍数性細胞については1群800個の分裂中期細胞を分析した．

10.　記録と判定

無処理対照，溶媒および陽性対照群と被験物質処理群についての分析結果は，観察した細胞数，構造異常の種類と数，倍数性細胞の数について集計し，各群の値を記録用紙に記入した．

染色体異常を有する細胞の出現頻度について，溶媒対照群と被験物質処理群および陽性対照群間でフィッシャーの直接確率法２）により，有意差検定を実施した(p<0.01)．また，用量依存性に関してコクラン・アーミテッジの傾向性検定３）(p<0.01)を行った．最終的な判定は，統計学的および生物学的な評価に基づいて行った．

結果および考察

連続処理による染色体分析の結果をTable 1に示した．アセト酢酸メチルを加えて24時間および48時間連続処理したいずれの処理群においても，染色体の構造異常および倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．

短時間処理による染色体分析の結果をTable 2に示した．アセト酢酸メチルを加えてS9 mix非存在下における短時間処理では，いずれの処理群でも染色体の構造異常は誘発されなかった．一方，倍数性細胞の誘発に関しては，傾向性検定(p<0.01)の結果，有意差が認められたが，いずれの群においても溶媒対照群と比較して有意差(p<0.01)は認められず，高濃度群(1.2 mg/mL)でも誘発頻度が 1.25 %と低かったことから，陰性と判定した．S9 mix存在下では，高濃度群(1.2 mg/mL)において，染色体の構造異常(gap を含む)および倍数性細胞の誘発が認められ，その誘発頻度は 11.0 %および 2.75 %であった．

アセト酢酸メチルのS9 mix存在下の高濃度(1.2 mg/mL)処理では，培養液が黄色化することから，本物質の染色体異常誘発に関しては，培養液の酸性化による可能性と，DNAに対する直接的な傷害作用による2つの可能性が考えられた．そこで，染色体異常が認められた S9 mix存在下の高濃度(1.2 mg/mL)群について，被験物質を含む培地のpHを中性域に調整して，確認試験を行った．その結果，染色体の構造異常および倍数性細胞の誘発は認められなかった(Table 3)．

これらの結果より，アセト酢酸メチル処理によって観察された染色体異常は，それ自身のDNA傷害作用に基づくものではなく，培養液の酸性化による非生理的な条件に起因して生じたことが示され，陰性と判断した．

文献

1)日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編，"化学物質による染色体異常アトラス," 朝倉書店，東京，1988．
2)吉村　功編著，"毒性・薬効データの統計解析，事例研究によるアプローチ," サイエンティスト社，東京，1987．
3)吉村　功，大橋靖夫編，"毒性試験講座14，毒性試験データの統計解析," 地人書館，東京，1992，pp. 218-223．

連絡先
試験責任者：田中憲穂
試験担当者：日下部博一，佐々木澄志，若栗　忍，井上みゆき，橋本恵子
(財)食品薬品安全センター　秦野研究所
〒257-8523　神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Noriho Tanaka(Study director)
Hirokazu Kusakabe, Kiyoshi Sasaki,
Shinobu Wakuri, Miyuki Inoue,
Keiko Hashimoto
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano, Kanagawa, 257-8523, Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627