N,N-ジメチルベンジルアミンの
細菌を用いる復帰突然変異試験
Reverse Mutation Test of N,N-Dimethylbenzylamine on Bacteria
要約
N,N-ジメチルベンジルアミンについて，細菌を用いる復帰突然変異試験を実施した．
検定菌として，Salmonella typhimurium(TA100，TA98，TA1535，TA1537)およびEscherichia coli(WP2 uvrA)の5菌株を用い，用量設定試験の結果をもとに，本試験ではS9 mix無添加群のTA100で78.1〜5000 μg/plateの7用量，同群のTA1535およびTA1537で 39.1〜2500 μg/plateの7用量，同群のWP2 uvrAおよびTA98ならびにS9 mix添加群の各試験菌株でそれぞれ156〜5000 μg/plateの6用量で試験を実施した．
その結果，S9 mix無添加群および添加群のいずれにおいても，溶媒対照に比べ復帰突然変異コロニー数の明確な増加は認められなかった．
以上の結果より，本試験条件下ではN,N-ジメチルベンジルアミンは，変異原性を有しない(陰性)と結論した．
方法
1. 試験菌株
細菌を用いる復帰突然変異試験に広く使用されていることから，試験菌株としてヒスチジン要求性のSalmonella typhimurium TA100，TA98，TA1535およびTA1537 1)ならびにトリプトファン要求性のEscherichia coli WP2 uvrA 2)の5種類の菌株を選択した．
ネズミチフス菌は昭和58年9月9日にカリフォルニア大学のB.N.Ames教授から，また，大腸菌については昭和58年3月16日に国立衛生試験所から分与を受けた．平成7年9月5日に菌株の特性検査を実施し，本試験に用いた菌株が規定の特性を保持していることを確認した．各菌株の菌懸濁液はジメチルスルホキシド(DMSO:MERCK社)を添加した後，凍結保存用チューブに0.2 mlずつ分注した．これを液体窒素を用いて凍結し，超低温フリーザーに-80℃で保存した．
2. 培地の調製
1) 最少グルコース寒天平板培地(プレート)
日清製粉(株)製のテスメディアAN培地を購入し，試験に用いた．本プレートは，Vogel-Bonnerの最少培地Eを含む水溶液(0.02%硫酸マグネシウム・7水塩，0.2%クエン酸・1水塩，1%リン酸二カリウム・無水塩，0.192%リン酸一アンモニウム，0.066%水酸化ナトリウム 〔いずれも最終濃度〕)に2%のグルコース(和光純薬工業(株))と1.5%の寒天(UNIPATH社:No. 1)を加え，30 mlをシャーレに分注したものである．
2) トップアガー(軟寒天)
Bacto-agar(DIFCO社)0.6%を含む0.5%塩化ナトリウム水溶液10容量に対し，ネズミチフス菌を用いる試験の場合，0.5 mM L-ヒスチジン(関東化学(株))-0.5 mM D-ビオチン(関東化学(株))水溶液を1容量加え，大腸菌を用いる試験の場合，0.5 mM L-トリプトファン(関東化学(株))水溶液を同じく1容量加え用いた．
3. 前培養条件
内容量200 mlの円筒容器(ストレージボトル:Corning Costar社)に2.5%ニュートリエントブロス(UNIPATH社)溶液を25 ml分注し，これに融解した菌懸濁液を50 μl接種した．ウォーターバスシェーカー(MM-10:タイテック(株))を用い，37℃で8時間振盪(往復振盪:120回/分)培養し，試験に使用した．
4. S9 mix
製造後6ヵ月以内のキッコーマン(株)製S9 mixを試験に使用した．S9 mix中のS9は誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製されたものである．S9 mixの組成を以下に示す．
| 成 分 | S9 mix 1 ml中の量 |
| S9 | 0.1 ml |
| MgCl2 | 8 μmol |
| KCl | 33 μmol |
| G-6-P | 5 μmol |
| NADPH | 4 μmol |
| NADH | 4 μmol |
| リン酸緩衝Na-液(pH 7.4) | 100 μmol |
| 精製水 | 残 量 |
5. 被験物質
被験物質のN,N-ジメチルベンジルアミン(ロット番号:50502，CAS No.:103-83-3)は分子式C9H13N，分子量135.23，純度99.93 wt%の液体である．広栄化学工業(株)から提供された被験物質を使用した．試験終了後，被験物質提供元において残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．
6. 被験物質溶液の調製
DMSOに被験物質を溶解して調製原液とした．調製原液を使用溶媒を用いて順次所定濃度に希釈した後，直ちに処理を行った(用時調製)．
7.試験用量の設定
4.88，19.5，78.1，313および1250 μg/プレートの用量を用いて予備的な試験を実施した．その結果，S9 mix無添加群のTA1535およびTA1537で1250 μg/プレートにおいて試験菌株に対する生育阻害作用が観察された．
従って，本試験においてはS9 mix無添加群のTA1535およびTA1537で2500 μg/プレート，同群の他の試験菌株ならびにS9 mix添加群の各試験菌株について5000 μg/プレートを最高用量とし，それぞれ6〜7用量(公比2)を設定した．
8. 陽性対照物質
陽性対照物質として下記に示した物質を使用した．これらの陽性対照物質は，DMSOを用いて溶解し，少量ずつ分注した後凍結保存(-20℃)した．
| 2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(AF-2:和光純薬工業(株)) |
| アジ化ナトリウム(NaN3:和光純薬工業(株)) |
| 9-アミノアクリジン(ACR:ALDRICH社) |
| 2-アミノアントラセン(2-AA:和光純薬工業(株)) |
9. 試験方法
Amesらの原法の改良法であるプレインキュベーション法 1)に準じて，S9 mix無添加群および添加群それぞれについて試験を実施した．試験管に，使用溶媒，被験物質溶液あるいは陽性対照物質溶液を100 μl，次いでS9 mix無添加群の場合，0.1 M ナトリウム・リン酸緩衝液(pH7.4)を500 μl，S9 mix添加群の場合，S9 mixを500 μlおよび試験菌液100 μlを加え，37℃で20分間振盪培養(プレインキュベーション)した．培養終了後，トップアガーを2 ml添加し，混合液をプレート上に重層した．37℃の条件で48時間各プレートを培養した後，被験物質の試験菌株に対する生育阻害作用を確認するため，実体顕微鏡(× 60)を用いてプレート上の試験菌株の生育状態を観察した．次いで，復帰突然変異により生じたコロニーを計数した．計測に際してはコロニーアナライザー(CA-11:システムサイエンス(株))を用いた．独立して試験を2回実施した．
10. 結果の解析
復帰突然変異コロニー数が溶媒対照のほぼ2倍以上に増加し，かつ，再現性あるいは被験物質の用量に依存性が認められた場合に，陽性と判定した．
なお，統計学的手法を用いた検定は実施しなかった．
結果および考察
1回目の試験結果をTable 1〜2に，2回目の試験結果をTable 3〜4に示した．S9 mix無添加群ならびに添加群のいずれも高用量群において，N,N-ジメチルベンジルアミン処理による生育阻害作用が観察された．また，復帰突然変異コロニー数については，S9 mix無添加群，S9 mix添加群とも溶媒対照と同等の値であり，明確な増加傾向は認められなかった．一方，陽性対照物質はそれぞれの試験菌株において，溶媒対照群の2倍以上の復帰突然変異コロニーを誘発した．なお，試験中析出等の特筆すべき変化は観察されなかった．以上の試験結果から，本試験条件下において，N,N-ジメチルベンジルアミンの微生物に対する遺伝子突然変異に関し，陰性と判定した．
文献
| 1) | D.M．Maron and B.N．Ames，Mutat．Res.，113，173(1983). |
| 2) | M.H.L．Green and W.J．Muriel，Mutat．Res.，38, 3(1976). |
| 連絡先 |
| 試験責任者: | 中嶋 圓 |
| 試験担当者: | 北沢倫世，藤原正孝，板倉真由実 |
| (財)食品農医薬品安全性評価センター |
| 〒437-12 静岡県磐田郡福田町塩新田字荒浜582-2 |
| Tel 0538-58-1266 | Fax 0538-58-1393 | |
| Correspondence |
| Authors: | Madoka Nakajima(Study director)
Michiyo Kitazawa，Masataka Fujiwara
Mayumi Itakura |
| Biosafety Research Center，Foods，Drugs and Pesticides(An-pyo Center)
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| 582-2 Shioshinden Aza Arahama, Fukude-cho, Iwata-gun, Shizuoka, 437-12, Japan
|
| Tel +81-538-58-1266 | Fax +81-538-58-1393 | |